[发明专利]大叶藻微卫星标记及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，特别涉及大叶藻微卫星标记及其筛选方法和应用。

背景技术

丛生大叶藻(Zostera caespitosa)是太平洋西北海岸特有的大叶藻属植物。山东半岛的大叶藻场主要由大叶藻(Zostera marina L)和/或丛生大叶藻二者共同构成。在这些海底草场中，丛生大叶藻覆盖面积与大叶藻相当，丛生大叶藻与大叶藻均为大叶藻属海草，较容易与同域分布的其他海草区分，但二者叶片形态特征相同，仅凭水面抓斗采集叶片样品，不能将二者分辨，目前只能通过科学潜水员水下观察鉴定。而大叶藻与丛生大叶藻在山东半岛草场中常常混生，为草场维护与研究带来了极大的困难。目前，国外研究人员积累的大量海底草场研究资料与生态修复经验，在排除丛生大叶藻的影响前，是不能应用于山东半岛大叶藻与丛生大叶藻的混生草场研究的。

微卫星DNA是目前最常见的分子标记，其特异性强，检测准确而快速等特性使其检测结果在司法鉴定领域成为黄金标准，在其他动植物遗传学研究中微卫星DNA标记用途广泛，其中之一便是作为分辨特定物种(或品种)与其相似物种(或品种)的工具。

发明内容

本发明提供一组适于大叶藻品种分类、遗传关系鉴定的微卫星标记，并提供该组微卫星标记的筛选方法，以及利用该组大叶藻微卫星标记对大叶藻基因型进行检测的方法，该检测方法仅通过分析抓斗采集的叶片样本，就可在实验室内实现大叶藻与丛生大叶藻快速准确分辨。

本发明人对目前全球广泛应用的23个大叶藻微卫星标记位点进行筛查，发现其中4个大叶藻微卫星标记位点在丛生大叶藻中普遍不存在，在PCR检测中结果为阴性；这4个含有大叶藻微卫星标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-4所示。

其中核苷酸序列SEQ ID NO：1的微卫星核心序列为：GAGAGAGAGAGAGAGA；核苷酸序列SEQID NO：2的微卫星核心序列为：CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT；核苷酸序列SEQ ID NO：3的微卫星核心序列为：ATGGATGGATGGATGGATGG；核苷酸序列SEQ ID NO：4的微卫星核心序列为：AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG。

本发明人对目前全球广泛应用的23个大叶藻微卫星标记位点进行筛查的具体方法如下：针对这23个大叶藻微卫星标记位点分别设计对应的引物，利用23对引物分别扩增采集到的49个丛生大叶藻样品与57个大叶藻样品的相应片段，选择符合以下特性的引物：

(1)、在最佳退火温度下，所有大叶藻样品中全部有特异性目标产物，且产物条带清晰，信噪比高，无非特异性扩增条带。

(2)、在最佳退火温度下，在全部丛生大叶藻中无PCR产物，背景清晰无噪音。

依照上面方法，共筛选到四个微卫星标记位点，这四个含有微卫星标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-4所示。

扩增这四个微卫星标记使用的引物是：

核苷酸序列SEQ ID NO：1：F：CGAACATGAATCTCCGAACC，R：GGTAAATGCACCCAGCTCTC；

核苷酸序列SEQ ID NO：2：F：CCCCATCTTTTGAGTTTGGA，R：TCATCATTTCTTGCAATTTGAATC；

核苷酸序列SEQ ID NO：3：F：CATTCCATTCAAGAGCAGCA，R：CAACAAATCAATCAATCATTCACTC；

核苷酸序列SEQ ID NO：4：F：AATCTGTTGCCACGAAGGAG，R：TCACCTTCATCAAGCAGTCG。

本发明还提供利用大叶藻微卫星标记对大叶藻基因型进行检测的方法，具体方法如下：首先提取大叶藻属基因组DNA并稀释备用；再利用大叶藻中含有的微卫星核心序列，使用特异性引物对大叶藻不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行凝胶电泳检测，从而确定大叶藻不同个体在微卫星标记核心序列区的基因型，其中大叶藻微卫星标记的特异性引物为：

核苷酸序列SEQ ID NO：1：F：CGAACATGAATCTCCGAACC，R：GGTAAATGCACCCAGCTCTC；

核苷酸序列SEQ ID NO：2：F：CCCCATCTTTTGAGTTTGGA，R：TCATCATTTCTTGCAATTTGAATC；

核苷酸序列SEQ ID NO：3：F：CATTCCATTCAAGAGCAGCA，R：CAACAAATCAATCAATCATTCACTC；