[发明专利]一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种适用于沙漠植物准噶尔无叶豆幼苗各种非生物胁迫下实时荧光定量PCR研究的内参分子的筛选方法

背景技术

随着全球气候变暖和温室效应加剧，干旱区农业生产受到严峻挑战。面对我国人口不断增长、耕地和水肥资源日益减少、粮食供需矛盾日益尖锐的严峻现实，如何在节约资源和改善环境的同时，快速提高作物的产量，已成为我国农业持续高效发展的重大需求。干旱区长期进化过程中积累的抗干旱基因资源是开展种质创新的源动力！

干旱区严酷的自然环境孕育了特殊的生物，其中尤以分布在流动沙丘上的极端耐旱沙生植物最具有代表性。沙生植物是一类特殊的植物类群，可在高效利用有效水分的同时，维持高效的光合作用，是宝贵的战略性植物资源。准噶尔无叶豆是沙生植物的典型代表。

准噶尔无叶豆(Eremosparton songoricum(Litv.)Vass.)系豆科无叶豆属超旱生无叶灌木，仅片断化分布于新疆古尔班通古特沙漠流动沙丘上，是典型的流沙先锋植物。该种是我国的单属种植物类群，西北荒漠植被中的标志性种，稀有种。由于长期生活在极端恶劣的流动沙丘环境中，沙漠干旱、少雨、大风、沙埋等环境塑造了准噶尔无叶豆抗旱的形态学及生理学特性，表现在该种为小半灌木，叶极端退化，以营养枝执行光合作用，故称“无叶豆”；具有超强的根吸水能力以及细胞持水能力，并保持高效的光合能力。此外，长期的环境压力使得该种具有抗旱，抗高温，抗风蚀沙埋等抵抗多种非生物胁迫的能力，其体内必定蕴含着丰富的抗逆基因资源。

要了解准噶尔无叶豆体内丰富的抗旱基因资源及其功能，很关键的一个方法就是要克隆抗旱基因并迅速、准确地定量检测抗旱基因在各种非生物胁迫下的表达。传统的印迹杂交，生物芯片技术和RT-PCR等手段在实时、定量检测抗旱基因表达量上，或存在缺陷，或价格昂贵、费时费力。随着分子生物学各项技术的发展，实时荧光定量PCR已经成为目前基因表达定量检测的主要方法，该法不仅灵敏度高，样品消耗量少，能检测出低丰度靶基因表达量，定量线性宽；而且可精确检测出同一处理不同组织、或者同一组织不同发育时期微小的基因表达水平差异。但是实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上依赖于筛选适合的内参基因对数据进行校正和标准化，从而避免不同标本在RNA的产量、质量及逆转录率上可能存在的差别。

以往对内参基因的研究证实，任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下有范围的恒定，在其他类型的细胞中或实验因素作用下则是变化的。若盲目的使用一个内参或几个内参基因，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能得到错误甚至是相反的结论。内参基因的稳定性问题近年来越来越受争议和关注。因此，研究和筛选特定植物中最稳定的内参分子和最合适的内参数目(或者说最优的内参组合)是进行荧光定量PCR实验的先决条件。目前，文献中用来作为植物基因表达分析的内参主要有18SrRNA，Actin，GAPDH等。因所研究植物的系统学谱系关系不同、生活型不同以及植物组织部位不同其选择内参也不同。

目前为止，对植物抗逆基因不同胁迫下表达量的研究多盲目参考在其他植物类群中使用过的内参，如Actin，18SrRNA等，但对其在极端耐旱沙生植物抗旱基因研究中的恒定性及其作为内参的适用性均未进行探究，并且开发新的内参分子尚未见报道。

近年来，从准噶尔无叶豆中已克隆出一些抗逆基因，如脱水响应元件结合蛋白(DREB)转录因子基因(NCBI登录号：HQ687367)，这些基因的特性和功能亟待研究，但关于该种的内参基因的序列资料未见报道，最合适内参分子的研究更是空白。因此，本发明就旨在探究一种在非生物胁迫条件下准噶尔无叶豆幼苗开展实时荧光定量PCR研究最稳定，最合适的内参分子的筛选方法，为以后大规模开展抗逆基因克隆及功能研究奠定基础。

发明内容