[发明专利]一种枯草芽孢杆菌及其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法

权利要求书

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌B7-S(Bacillus subtilis B7-S)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2011162。

2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：

(1)出发菌种的选择：出发菌种为枯草芽孢杆菌B7(Bacillus subtilis)，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC NO：1.210；

(2)制备种子培养基：将10.0～20.0g胰蛋白胨、2.0～6.0g牛肉浸膏、5.0～20.0g氯化钠、0.2～2.0g阿魏酸与1.0L蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm²、温度为121℃的条件下灭菌20min，即得阿魏酸浓度为0.2～2.0g/L的种子培养基；

(3)诱导：将一环生长良好的所述出发菌种枯草芽孢杆菌B7(Bacillus subtilis)斜面培养物，按5～20％的接种量接种至含有50～150ml的所述种子培养基的摇瓶中，按阿魏酸浓度自低浓度至高浓度进行继代培养，并置于恒温振荡器上，在25～45℃的条件下以50～200r/min的速率进行振荡培养，诱导周期为45～60天，即获得枯草芽孢杆菌B7-S。

3.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，包括以下步骤：

(1)制备种子培养基：将10.0～20.0g胰蛋白胨、2.0～6.0g牛肉浸膏、5.0～20.0g氯化钠、0.2～2.0g阿魏酸与1.0L蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm²、温度为121℃的条件下灭菌20min即得阿魏酸浓度为0.2～2.0g/L的种子培养基；

(2)将一环生长良好的所述枯草芽孢杆菌B7-S斜面培养物按5～20％的接种量接种至含有50～200ml所述种子培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在25～45℃的条件下以50～200r/min的速率进行振荡培养30～60h，至菌液OD_660nm为0.5～0.8时即获得枯草芽孢杆菌B7-S转化用菌液；

(3)收集菌体细胞：取所述枯草芽孢杆菌B7-S转化用菌液在离心机上以1000～4000r/min的转速离心5～20min，收集上清液；对所述上清液以5000～20000r/min的转速离心5～20min，得到菌体细胞沉淀；

(4)转化：将0.2M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液加到所述菌体细胞沉淀中，形成菌体浓度为3.0×10⁷～8.0×10⁷个/ml的菌悬液；然后加入浓度为0.2～2.0g/L的阿魏酸，在25～45℃温度下、通气量为0.5～1.5L/min，以200～500r/min的转速进行转化，40～60h后，得到转化液；

(5)香兰素的分离：将所述转化液在离心机上以2000～4000r/min的转速离心5～20min，得到香兰素粗沉淀物；

(6)香兰素粗品的制备：将所述香兰素粗沉淀物在温度为50～80℃、压力为0.05～0.10Mpa的条件下，真空干燥60～100h，得到干燥的沉淀物，该干燥的沉淀物用研钵研成粒度为200～300目的粉末后，即得香兰素粗品。

4.如权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，其特征在于：所述步骤(4)中0.2M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)是指首先将71.6g Na₂HPO₄·12H₂O溶于1000ml水，得到0.2M Na₂HPO₄；然后将31.2g NaH₂PO₄·2H₂O溶于1000ml水，得到0.2M NaH₂PO₄；最后，将19ml 0.2M的NaH₂PO₄和81ml 0.2M的Na₂HPO₄混合均匀后即得。

5.如权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，其特征在于：所述步骤(4)中通气量中的空气是指将空气经活性炭过滤后得到的无菌空气。