[发明专利]一种siRNA输送载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种siRNA输送载体及其在制备癌症的基因治疗药物中的应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的在生物界普遍存在的一种古老的生物学现象，是生物进化的产物。具体是指由双链RNA(double strand RNA，dsRNA)指导的，在特定酶参与下，以外源或内源mRNA为降解目标，在转录后水平上使特异性靶基因发生的沉默现象，即不表达。目前研究表明，RNAi广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物的大多数真核生物中，原核生物暂未发现。RNAi不仅参与了细胞正常的生长、发育、衰老和凋亡的调控，还可使外源基因导入时或病毒入侵后基因不被表达，从而成为生物体的一种有效的特异性自我防御机制。RNA干扰能特异而有效的阻断靶基因的表达外源性或内源性dsRNA，在细胞内导致与其序列同源的分子发生特异性降解，从而干扰相应基因的表达。dsRNA引起RNA干扰的过程为：核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的siRNA，大小约21-23bp。siRNA具有一些特征性结构：即siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基。此外，每条单链的3′端均有2-3个突出的非配对的碱基，这种结构形式对siRNA进入蛋白复合体是必须的。siRNA是RNAi赖以发生的重要中间效应分子。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义链再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。携带反义链的的RISC与mRNA的互补序列特异性结合并切割mRNA。被切割后断裂的mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞内特定mRNA的降解反应。RNAi具有普遍、高效、特异、操作简单等突出优点，目前该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

胃癌的发生是一个多步骤多阶段的过程，其特征是原癌基因的激活和抑癌基因的失活。还有凋亡相关基因的异常表达、部分自分泌生长因子和受体的过量表达也与细胞癌变有密切关系。研究发现，多个分子标志物与胃癌转移潜能相关，其中研究较为深入的包括CD44异构体6(CD44 variant isoform 6，CD44v6)。CD44由一个包含20个外显子的基因编码，其中10个外显子是组成型外显子，另外10个外显子可选择性拼接而被称为变异外显子(variant exon，v1-v10)。仅含有组成型外显子称为CD44标准体(CD44 standard form，CD44s)，而含有变异外显子则为CD44异构体(CD44 variant isoform，CD44v)。CD44s广泛存在于在正常组织和癌组织中，而CD44v主要出现在机体的病理过程，特别是肿瘤的发生发展过程中。CD44v胞内区域与下游因子的选择性相互作用在协调细胞内信号通路起着重要作用，如Rho/Ras、酪氨酸激酶途径等，并与肿瘤细胞生长、迁移和侵袭作用密切相关。CD44v6是目前研究较为广泛的异构体，被认为是上皮起源恶性肿瘤，包括肝细胞癌，乳腺癌，结直肠癌和胃癌发生转移的分子标志物，尤其是胃癌发生转移相对特异的分子标志物，制备抗CD44v6单链抗体用于进展期胃癌的生物治疗，可以封闭性结合胃癌组织表达的CD44v6，阻断其与细胞外间质或基底膜的正常连接及其所促进的肿瘤细胞浸润转移，延缓肿瘤进展；破坏CD44v6蛋白在肿瘤细胞表面形成的糖蛋白伪装，有利于免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀灭，抑制肿瘤的淋巴转移。采用RNAi技术可特异地抑制相关基因的表达，使这些基因呈现沉默或休眠状态.从而达到肿瘤治疗的目的。与传统的基因治疗的方法相比，RNAi能够实现同一基因家族的多个基因同时敲除，且抑制效果互不干扰，因为其特有的优势成为基因治疗的新策略。