[发明专利]一种从乳腺生物反应器表达产物中分离重组人抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗体分离纯化领域，具体地，涉及一种从乳腺生物反应器表达产物中分离重组人抗体的方法。

背景技术

利用转基因技术可以在哺乳动物乳腺生物反应器中高效地表达重组蛋白。目前，世界上约有三十家公司致力于开发动物乳腺生物反应器表达的重组蛋白药物，约有上百种重组蛋白正处于研发阶段，包括越来越被重视的重组人抗体。然而，与其它重组蛋白相比，乳腺生物反应器表达的重组人抗体的纯化有其特殊的困难。在转基因哺乳动物(动物I)乳液中，除表达的重组人抗体之外，还有动物I自身表达的抗体。动物I自身表达的抗体作为一种外源蛋白，能够导致部分人群的过敏甚至免疫混乱，因此需要严格限制其在纯化所得重组人抗体蛋白产品中的含量。人抗体和动物抗体的结构相似，等电点、分子量等理化性质非常接近，导致两者的分离难度极大，目前尚未看到分离人抗体和其它哺乳动物抗体的相关报道。

亲和层析是一种利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的层析技术。例如，将重组蛋白作为抗原可制备得到相应的抗体，将该抗体作为亲和配基与适当基质偶联形成亲和介质，可以对分离物料中的目标蛋白质进行分离纯化，该技术具有高效、快速、方便等优点。抗体可变区(Fab)片断作为抗体的功能区域，可以单独作为亲和配基使用，同样可以高效、快速地纯化目标蛋白质。

利用动物I自身表达的抗体作为抗原，利用动物杂交瘤细胞技术可以制备针对动物I抗体种属特征区域的单克隆抗抗体，并可以采用相关技术制备得到抗抗体的可变区片断。由于动物I抗体和抗抗体的结合部位位于动物I抗体的恒定区，与抗体的可变区无关，因此抗抗体或其可变区片断可以有效地结合所有动物I表达的多克隆抗体。

由于抗抗体针对表位的是动物I抗体种属特征区域，因此不会与重组人抗体发生结合，包括重组全基因人抗体、嵌合抗体以及人源化抗体，因此可以有效地分离乳腺生物反应器表达的重组人抗体以及动物I抗体；除人和动物I本身外，其它动物来源的，针对动物I抗体种属特征区域的抗抗体或其可变区片断均可以作为亲和配基有效地分离重组人抗体和动物I抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从乳腺生物反应器表达产物中分离重组人抗体的方法。

为实现以上目的，根据本发明的从乳腺生物反应器表达产物中分离重组人抗体的方法包括如下步骤：

(1)将乳腺生物反应器所产转基因动物乳液进行脱脂预处理，获得脱脂乳；

(2)将所得脱脂乳进行去除酪蛋白处理，获得含目标抗体的乳清液；

(3)将所得乳清液进行粗分离处理，获得含目标抗体的粗分离样品；

(4)将所得粗分离样品进行免疫亲和层析，从穿透峰中获得目标抗体；或者

(1)将乳腺生物反应器所产转基因动物乳液进行脱脂预处理，获得脱脂乳；

(2)将所得脱脂乳进行去除酪蛋白处理，获得含目标抗体的乳清液；

(3)将所得乳清液进行免疫亲和层析，收集穿透峰；

(4)将所得穿透峰进行精分离处理。

根据本发明的从乳腺生物反应器表达产物中分离重组人抗体的方法，其中，所述的转基因动物乳液为不同转基因哺乳动物的乳液，优选为牛乳；所述的重组人抗体优选为重组抗CD20人单克隆抗体、重组抗CD25人单克隆抗体、重组抗乳腺癌人单克隆抗体BG6等，但本发明的保护不局限于此。

根据本发明的从乳腺生物反应器表达产物中分离重组人抗体的方法，其中，为了去除转基因哺乳动物乳液原料中的脂类物质，避免其在后续纯化步骤中对层析介质或膜造成污染，需要对乳液进行脱脂处理，所述脱脂预处理方法为座式离心或碟式离心，其中，对于座式离心法，室温下10,000g离心30分钟使原料分层并去除上层脂类，收集下层液体即脱脂乳；对于碟式离心法，将乳液原料加温到48℃进料到碟式离心机中，3000g离心分离得到脱脂乳，其中，座式离心或碟式离心脱脂均可以去除原料中95％以上的脂类。

根据本发明的从乳腺生物反应器表达产物中分离重组人抗体的方法，其中，由于动物乳液原料中的酪蛋白以粒径为30～300nm的胶束颗粒形式存在，容易在后续层析纯化步骤中堵塞介质孔道，或在后续超滤步骤中堵塞超滤膜孔从而造成严重的污染，因此需要予以去除，所述去除酪蛋白方法为酸性沉淀或钙盐沉淀或凝乳酶处理或超滤，具体方法为：

酸性沉淀法，在室温下将脱脂预处理后所得脱脂乳调节pH到4.0～5.0，优选pH值为4.5～4.8，静置15分钟后离心收集上清液，得到乳清液；