[发明专利]一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法。

背景技术

心脑血管疾病如脑中风、冠心病以及外周血管血栓等严重影响人们生活质量、并造成沉重经济负担。作为自然界的野生资源之一，毒蛇毒液中含有许多生物活性多肽和蛋白质，包括对机体循环系统有重要影响的组分。利用蛇毒研制开发新的治疗血栓的药物，成为国内外研究的热点之一。基于天然蛇毒资源以及产品纯度方面的限制，单纯依靠改进工艺已经不能满足需要，而通过现代基因工程技术可获得大量的蛇毒重组蛋白，这也符合现代生物药物的发展趋势。同时随着地区城市化及农村经济的发展，蛇类栖息地受到越来越多的破坏，有些蛇类也许在我们获得其基因信息之前就灭绝了。利用宝贵的蛇毒资源造福人类，是具有广泛应用前景。

在蝰亚科、蝮亚科等蛇类蛇毒中含有能直接溶解纤维蛋白或纤维蛋白原的酶，如纤维蛋白(原)溶酶(简称纤溶酶)(Fibrinolytic enzyme)、类凝血酶(Thrombin-like enzyme)。纤溶酶可以作用于纤维蛋白和纤维蛋白原的Aα和Bβ亚基，将纤维蛋白和纤维蛋白原水解成片段而可起到抗凝、溶栓作用。类凝血酶可以水解纤维蛋白原的A链或B链，且不激活XIII因子，因此产生了非交联的可溶性纤维蛋白单体，使其不能形成血栓，同时可以大量消耗纤维蛋白原而达到抗凝效果。临床上已经应用的类凝血酶有：Ancrod、Crotalase、Batroxbin、Flavoxobin、Bothrombin及Defibrase等。有的类凝血酶除有抗凝血活性外还有其它活性如出血活性、神经毒性等。研究表明蝮蛇纤溶酶和类凝血酶是一组蛋白水解酶的混合体。由于各种抗凝组分的理化性质比较接近，给分离提纯工作带来一定的困难。目前对蛇毒蛋白的分离纯化方法是利用色谱技术获得单一组分，然后通过不同的生化实验来确定所得蛋白组分的生物学特性。抛开烦琐的蛋白质纯化不言，就是确定所得蛋白的生化特性也颇为困难。因此有必要应用基因工程方法，来获得具有重要生物活性的蛇毒蛋白。

发明内容

为了实现上述目的，本发明提供一种利用生物工程方法制备出具有活性的蛇毒类凝血酶。

本发明提供了上述方法制备的类凝血酶蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)制备蛇毒类凝血酶基因；所述的蛇毒类凝血酶基因如SEQ ID NO：1所示；

2)将蛇毒类凝血酶基因克隆入质粒载体中，构建原核表达载体；

3)用原核表达载体转化大肠杆菌；

4)挑取含表达载体的单克隆菌株在37℃下过夜振荡培养至A600＝0.6-0.8，加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.7mmol/L，18℃振荡培养8小时，诱导表达蛇毒类凝血酶蛋白；

5)收集菌体，-80℃冻存；重新取出菌体，加入裂解液，搅匀，冰上超声破菌；

6)在4℃，8000g下离心10分钟，收集上清，进一步纯化制备类凝血酶蛋白。

所述的蛇毒类凝血酶基因是通过下述方法获得的：

a)小心分离新鲜蛇毒毒腺，提取组织RNA，并进一步提取分离m RNA，反转录获得cDNA；

b)cDNA双链进行末端补平，补平后的cDNA末端加上EcoR I和Hind III酶切位点；

c)已加酶切位点的cDNA双链片段用EcoR I和Hind III限制性内切酶酶切，酶切片段连入T7载体，连接产物加入到包装蛋白中进行噬菌体体外包装；

d)以纤维蛋白原作为特异性底物淘选噬菌体：将纤维蛋白原稀释至浓度为10μg/ml，用封闭液将其包被在ELISA板上；包被好的ELISA板，每孔加入包装好的噬菌体100μl，室温孵育2小时；用TBST溶液洗板5次，加洗脱液在室温孵育20分钟，从ELISA板上洗脱噬菌体，完成第一轮淘选；

再按上述方法以第一轮淘选噬菌体为基础，再进行两轮淘选，获得强亲和性的含目的基因的噬菌体群；

e)从上述噬菌体群中分离培养单个的噬菌体，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物，PCR扩增获得蛇毒类凝血酶基因。

本发明提供的技术方案具有如下的优点：