[发明专利]一种检测BYD病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测BYD病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。

背景技术

BYD病毒，以其分离地白洋淀(Bai Yang Dian)首字母命名，属黄病毒属成员，与Tembusu病毒亲缘关系较近，该病毒感染鸭后可导致鸭产蛋下降综合征(Duck Egg-Drop Syndrome，DEDS)。该病于2010年首次发现，传染性非常强。病鸭主要病症为高热、食欲废绝、产蛋下降甚至停止，发病较重的鸭禽甚至丧失行动能力，剖检可见卵巢发生出血、萎缩、破裂等严重病变。我国沿海鸭禽养殖省区包括北京、安徽、河北、福建、广东，广西、江苏、江西、山东、浙江均有流行，无论肉鸭还是蛋鸭均可被该病毒感染，死亡率为5～15％，给各地鸭禽养殖业造成重大经济损失。

该病尚无有效的检测手段，血清学上与我国常见黄病毒如登革病毒、日本脑炎病毒等存在一定的血清学交叉反应，目前仅有文献报道采用普通逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测该病原。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)法具有在等温条件下即可高速、快速、高特异、高灵敏的扩增靶序列的特点。该方法利用特异引物在高活性链置换DNA聚合酶作用下，不断大量复制扩增核酸。核酸大量合成时，dNTP会析出大量的焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg²⁺(或Mn²⁺)结合，产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀，从而引起反应液的浊度变化，非常易于判断。此外，利用一些荧光燃料，如SYBR green I染料或者钙黄绿素指示LAMP反应。SYBR green I染料可与双链DNA产物结合，当有产物大量扩增时，反应体系呈现显著的荧光信号变化。钙黄绿素在反应初始时与Mn²⁺结合，反应液显示透明的橙色，当有核酸产物大量合成时，会生成副产物焦磷酸根，使Mg²⁺游离出来，与钙黄绿素结合，最终使反应液显示微浊的黄绿色。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测BYD病毒的专用引物。

本发明提供的专用引物，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

所述专用引物还包括引物5，所述引物5的核苷酸序列为序列表的序列5。

所述专用引物由所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5组成。

所述BYD病毒具体为BYD病毒Byd1株。

所述专用引物中，F3(引物1)、B3(引物2)、FIP(引物3)、BIP(引物4)和LB(引物5)还可进行碱基的替换和/或取代，保持3’末端序列6个碱基100％的同源性即可。FIP和BIP中TTTT(下划线者)为连接序列，其长度一般为4个，数目可相应缩短和延长。

本发明的第二个目的是提供一种检测BYD病毒的环介导等温扩增(LAMP)试剂。

本发明提供的试剂，包括RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2×环介导等温扩增缓冲液、所述的专用引物。

所述扩增试剂还包括钙黄绿素；

所述扩增试剂由RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2×环介导等温扩增缓冲液、所述的专用引物和钙黄绿素组成；

所述的专用引物中的引物1和引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为5pmol/L；所述的专用引物中的引物3和引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为40pmol/L；所述的专用引物中的引物5在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为20pmol/L；

所述的引物5可与茎环结构结合启动链置换合成，提高扩增效率。扩增的最后产物是具有不同个数的茎环结构、不同长度DNA的混合物，其产量可达10μg以上，是普通PCR反应DNA产率的至少50倍。

所述RNA逆转录酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为0.004U/μL；

所述RNA逆转录酶具体为AMV逆转录酶；

所述Bst DNA聚合酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为0.32U/μL；

所述钙黄绿素在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为50μmol/L；