[发明专利]FITC-IP3的制备方法及在荧光偏振分析中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及靶向药物功效预测方法的技术领域，具体的，涉及FITC-IP₃的制备方法及其在荧光偏振分析中的应用。

背景技术

1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP₃受体）是调节Ca²⁺释放的配体门控通道。该受体可以结合IP₃后被激活。IP₃受体是四聚体。每个亚单位包括2700个残基，每个亚基N末端（NT，1-604）附近具有IP₃结合中心（IBC，224-604），C-末端具有6个跨膜蛋白。最末端的一对跨膜区域，连同其四个亚单位的每个转弯环区，构成孔隙结构。当3～4个部位被IP₃占据时, IP₃受体复合物构象发生改变, 打开孔隙结构, 储存的Ca²⁺ 随即释放。因此，寻找IP₃受体靶向药物的必经步骤是筛选与IP₃受体亲和力高或活性强的化合物并预测此类化合物的药物功效。

1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。以一束单一波长的偏振光照射溶液中的荧光物质，后者可吸收并释放出相应的偏振荧光。如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性，如果其处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性，也就是所谓荧光去偏振现象。

近年来，以这种物理学现象为基础的技术正在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。本申请人将荧光偏振现象结合现代物理中的热动力学应用于药学研究当中，发明了一套高通效的药物功效预测技术。由于该高通效的药物功效预测技术采用的荧光偏振的原理，因此需要设计相应的荧光配体配合使用。  

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种荧光标记的化合物FITC-IP₃的制备方法，该制备方法得到的FITC-IP₃适合于IP₃受体的荧光偏振分析。

本发明所要解决的技术问题还包括FITC-IP₃在荧光偏振分析中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：FITC-IP₃的制备方法，包括如下步骤：

（1）反应体系配置：将2-氧-(2-氨乙基)-IP₃溶解于四氘代甲醇中，添加三乙基胺，再添加FITC 固体；

（2）将上述反应体系摇匀后，避光室温孵育48h；

（3）上述步骤所得到的混合物纯化后，即得到产物FITC-IP₃。

上述技术方案中，选用2-氧-(2-氨乙基)-IP₃ 作为原料，因为在IP₃的带电磷酸基团附近具有活性氨基，这使得2-氧-(2-氨乙基)-IP₃的活性乙基与与活性染料FITC的连接反应在反应体系中更加有竞争力。在普通条件下这个反应是非常缓慢的，并且活性染料本身存在水解反应，所以合成FITC-IP₃时需要过量使用活性染料。但是，本发明人发现，在四氘代甲醇环境中，添加三乙基胺后，FITC可以选择性地与2-氧-(2-氨乙基)-IP₃起反应。

本发明进一步的技术方案，FITC-IP₃的制备方法，包括如下步骤：（1）反应体系配置：将20 μmol 2-氧-(2-氨乙基)-IP₃溶解于0.75 ml四氘代甲醇中，添加50μl三乙基胺，再添加50 μmol FITC 固体。（2）将上述反应体系摇匀后，避光室温孵育48h。（3）上述步骤所得到的混合物纯化后，即得到产物FITC-IP₃。

进一步的技术方案，所述步骤（2）中20 μmol FITC 固体分两次加入，第一次添加30 μmol FITC固体，封口，摇匀，避光室温孵育4h；此时第二次添加20 μmol FITC固体，继续避光室温孵育44h。