[发明专利]培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法

说明书

本申请是申请号为201110127667.4，发明名称为培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法的中国发明专利申请(申请日为2011年5月17日)的分案申请。

技术领域

本发明涉及培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法，特别是用于上皮细胞培养的培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法。

背景技术

人体重要器官如肺、肾、肝、胰腺和皮肤都由器官特异性分化的上皮细胞为其组成成分。这些特异性分化的上皮细胞与不同器官的特异性功能直接相关，如肺的气体交换功能、肾的过滤功能、肝的解毒及中和功能、胰腺细胞产生胰岛素、皮肤具有保护机体免受外界环境的伤害。而这些重要器官一旦发生病变或退化就会威胁人类的健康，因为这些重要器官是很难被替换的，不同器官的特异性细胞也不能相互取代其它器官的细胞。

特异性分化的细胞，如肾上皮细胞、胰腺的胰岛素产生细胞、真皮的毛囊和腺体细胞都是很难再生的，更不要说在体外进行培养增殖了。实验动物(包括各种转基因和克隆动物)是用于疾病发病机理研究和新药研发的必要工具。但是，对于分离自人和哺乳动物的原代上皮细胞的体外培养仍然是很困难的。应用目前的无血清培养基，有的只能进行短期的原代培养(存活数天，如肺和胰腺等上皮细胞)，有的只能进行有限的传代培养(1-3代，如气管/支气管及前列腺等上皮细胞)，有的甚至根本不能体外培养(如肝和结肠等上皮细胞)，只有来自于人体皮肤的角化上皮细胞可以传代培养10代左右。而且从每个动物或活体组织样品中获得的上皮细胞产量仍然很低，包括细胞的数量、直接分离或短期培养的细胞纯度都是很低的，这些原代和传代上皮细胞的增殖速度也极为有限。

为了在体外进行上皮细胞的培养，目前国外尝试通过遗传操作，如转入病毒(SV40T或HPV16E6E7)或细胞癌基因，可以延长体外细胞存活的代数。然而遗传操作的最大缺点是会改变这些细胞的遗传背景和表型，以致让这些正常上皮细胞丢失其正常生理功能，如p53和pRB信号通路常常被抑制。而且，这些经遗传修饰的细胞是不可能重新再移植进机体的。但是由于目前缺乏有效的体外培养上皮细胞的技术，上述这些细胞在当今世界的医学和生命科学研究中仍然备受青睐。在非癌症研究领域，它们就代表着最初来源的“功能”性的组织或器官。在癌症研究领域，它们还常常被用来作为“正常细胞”对照。而且它们的市场价格还非常昂贵。

抗肿瘤药物研究的第一步就是药物对癌细胞的特异性毒性实验，目前所用的癌细胞株(如HeLa和A539等)多在体外传代数年甚至数十年，它们在很大程度上已不能反应同类型人体恶性肿瘤的特性，一些实验室还存在大量癌细胞株的交叉污染。而且对于不同的个体，即使同一类型的肿瘤也可能由不同的原因或机制所导致，因此对于每一种肿瘤，都需要有能代表其特定发病机制的细胞株来进行新药研发。更为突出的例子，如前列腺癌的研究领域根本没有人类原发前列腺癌的细胞系，仅有的细胞系(LnCAP，PC-3，DU-145)都是来自转移后的肿瘤组织。尽管如此，全世界90％以上的肿瘤研究和几乎所有抗癌新药的研究还在继续使用着可能根本没有代表性的癌细胞株。因此，目前癌症研究和新药研发要解决的关键问题是，如何能获得反应各种类型人体肿瘤特性、同种肿瘤代表不同个体特性或不同发病机制的癌细胞。当然，归根结底的真正难题是缺乏有效的上皮细胞的原代和传代培养技术。另外，抗肿瘤药物存在的很多毒副作用，很大程度上是因为新药研究缺乏正常的细胞对照。若能得到来自于同一个体同一组织的癌细胞和正常细胞(美国Asterand公司用上述HPVE6E7转化得到的所谓的“正常”和癌的前列腺细胞，价格虽然高达1,2000美金/对，但还是十分抢手)，新药研发的第一步将会回归科学，抗癌新药研究的历史必将重写。

再生医学是现代临床医学的一种崭新的治疗模式，即以再生、再造、代替和新生为基本治疗原理的现代干细胞移植治疗术，利用干细胞(胚胎干细胞和成体干细胞)具有向各种细胞分化转变能力，治疗临床上众多的、目前尚无治疗办法的变性、坏死性和损伤性疾病，具有显著和独特的医疗效果。然而目前面临的困境是，虽然胚胎干细胞具有分化能力，再生性和可塑性强，但可能致瘤和面临伦理争议，如何诱导其定向分化和增加移植的成活率仍然是未解的难题；而成体干细胞来源稀少，难以识别、分离及纯化，因此阻碍了其临床应用；目前新兴的研究热点——诱导性多能干细胞，由于其涉及遗传操作导致细胞遗传背景的改变，且导入的外源基因和病毒基因有致癌或致畸的潜能而不能用于临床治疗。