[发明专利]一种质粒型腺病毒载体pAd-NRIP1及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有NRIP1基因的质粒型腺病毒载体，该质粒型腺病毒载体腺病毒载体的构建以及在改造种子细胞和牛NRIP1功能鉴定的应用。 

背景技术

AdEasyTM系统是由T.C.He等(1998)构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：1)腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2)基因组过大(36kb)，难于操作。 

在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组 则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这两点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体， 将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PacI线性化，暴露其反向末端重复序列(ITR，Iaverted Termined Repeats)，转染293A细胞后产生重组病毒颗粒。 

同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重 要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5α等进行扩增。由于缺乏recA活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重组。 

与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需1～3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5α中扩增后转入哺乳动物细胞293A，最后将293A细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供E1区功能的293A细胞中进行增殖。 

一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需1小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。 

1995年Cavailles等(Cavailles，Dauvois et al.1995)从雌激素处理的ZR75-1孔腺癌细胞中鉴定出NRIP1，NRIP1成为最早发现的核受体辅助因子之一。1998年Lee等(Lee，Chinpaisal et al.1998)通过酵母双杂交实验分离出小鼠的NRIP1 cDNA。其后，人们鉴定出了大鼠、家兔狗等动物的NRIP1 cDNA。 

NRIP1基因在各组织中广泛表达，且在脂肪、肝脏、肌肉等代谢组织中高表达。NRIP1蛋白定位于细胞核内，Gupta等(Gupta，Ho et al.2008)报道NRIP1经PKCε磷酸化修饰后，NRIP1蛋白向细胞质转位。因此，NRIP1蛋 白的亚细胞定位很可能受到多种机制调节。