[发明专利]一种检测S1核酸酶及其抑制剂的荧光方法有效
申请号: | 201110245341.1 | 申请日: | 2011-08-25 |
公开(公告)号: | CN102321759A | 公开(公告)日: | 2012-01-18 |
发明(设计)人: | 黄维;刘兴奋;苗丽坤;范曲立;马延文 | 申请(专利权)人: | 南京邮电大学 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68;C12Q1/44;G01N21/64 |
代理公司: | 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 | 代理人: | 叶连生 |
地址: | 210003 *** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 s1 核酸酶 及其 抑制剂 荧光 方法 | ||
1.一种检测S1核酸酶及其抑制剂的荧光方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
a.将染料标记的寡核苷酸荧光探针加入到缓冲溶液中,以480nm为激发波长,进行荧光检测,记录该探针的荧光发射谱带;
b.将氧化石墨烯加入到上述溶液中,氧化石墨烯作为固相载体吸附自由卷曲状态的寡核苷酸探针,形成寡核苷酸/氧化石墨烯复合物,此时染料的荧光被氧化石墨烯猝灭;
c.经S1核酸酶切割的寡核苷酸互补链,加入到寡核苷酸/石墨烯复合物中进行反应;
d.寡核苷酸互补链经过S1核酸酶的特异性降解作用形成小的碱基片段,无法与氧化石墨烯表面的寡核苷酸链探针形成双螺旋结构,从而寡核苷酸探针不能脱离氧化石墨烯的表面,染料的荧光信号不能恢复;根据荧光信号恢复的程度实现对S1核酸酶的定性及定量检测;
e.寡核苷酸互补链在抑制剂腺苷三磷酸存在下经S1核酸酶降解作用,加入寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中进行反应;
f.寡核苷酸互补链在抑制剂腺苷三磷酸存在下不会被S1核酸酶降解,与寡核苷酸探针形成双螺旋结构,寡核苷酸探针脱离氧化石墨烯的表面,染料的荧光信号得以恢复;根据荧光信号恢复的程度实现对抑制剂腺苷三磷酸的定性及定量检测。
2.根据权利要求1所述的检测S1核酸酶及其抑制剂的荧光方法,其特征是步骤a)所述的将染料标记的寡核苷酸荧光探针加入到缓冲溶液中,用荧光分光光度计进行检测,所用染料为荧光素;染料标记在寡核苷酸探针的5’端;寡核苷酸探针碱基组成为:5’-FAM-ATCTTGACTATGTGGGTGCT-3’;所用缓冲溶液为20mMTris-HCl,100mM NaCl,5mM KCl,5mM MgCl2,pH=7.4;所用荧光检测方法为:将探针溶液加入到1.6mL缓冲溶液中进行荧光发射光谱的扫描,激发波长为480nm,发射波长扫描范围为490-650nm。
3.根据权利要求1所述的检测S1核酸酶及其抑制剂的荧光方法,其特征是步骤b)所述的寡核苷酸/氧化石墨烯复合物的形成,是通过非共价键相互作用使寡核苷酸探针吸附到氧化石墨烯表面;寡核苷酸吸附到氧化石墨烯表面后,染料的荧光被氧化石墨烯猝灭,将氧化石墨烯加入到含有寡核苷酸探针的缓冲溶液中后,室温放置5分钟,然后进行荧光检测,激发波长为480nm,扫描范围为490-650nm。
4.根据权利要求1所述的检测S1核酸酶及其抑制剂的荧光方法,其特征是步骤c)经S1核酸酶切割的寡核苷酸互补链,加入到寡核苷酸/石墨烯复合物中进行反应,所用的寡核苷酸互补链探针碱基组成为:5’-AGCACCCACATAGTCAAGAT-3’;加入含有S 1酶的寡核苷酸互补链溶液或其它等体积的对照溶液后荧光信号恢复所用的时间为室温,25分钟左右。
5.根据权利要求1所述的检测S1核酸酶及其抑制剂的荧光方法,其特征是所述的荧光信号用荧光分光光度计进行检测,激发波长为480nm,发射波长扫描范围为490-650nm。
6.根据权利要求1所述的检测S1核酸酶及其抑制剂的荧光方法,其特征是所述的荧光探针为任意一段单链寡核苷酸,染料标记在5’端,或是3’端。
7.根据权利要求1所述的检测S1核酸酶及其抑制剂的荧光方法,其特征是所述的染料标记是荧光素或异硫氰酸荧光素。
8.根据权利要求1所述的检测S1核酸酶及其抑制剂的荧光方法,其特征是步骤d)所述的寡核苷酸互补链经S1核酸酶降解作用,是通过S1核酸酶对单链DNA或RNA特异性的降解作用,形成5’磷酸结构。
9.根据权利要求8所述的检测S1核酸酶及其抑制剂的荧光方法,其特征是S1核酸酶对寡核苷酸互补链的酶切过程所用酶切溶液为2mM CH3COONa,15mMNaCl,0.1mM ZnSO4,pH=4.6;酶切温度为37℃,时间为30分钟。
10.根据权利要求1所述的检测S1核酸酶及其抑制剂的荧光方法,其特征是步骤e)所述的寡核苷酸互补链在抑制剂腺苷三磷酸存在下经S1核酸酶降解作用,是腺苷三磷酸能够抑制S1核酸酶对单链DNA或RNA切割的特异性降解作用;当抑制剂腺苷三磷酸存在时,S1核酸酶对寡核苷酸互补链的作用条件与上述酶切条件相同。
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