[发明专利]核酸等温扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸等温扩增方法，具体地涉及这样的核酸等温扩增方法，其中靶RNA链到模板DNA链中的逆转录反应在具有该模板DNA链的扩增反应的一系列步骤(程序，procedure)中实施。

背景技术

PCR(聚合酶链反应)已被用作核酸扩增方法的一种方法。在PCR中，模板DNA链通过包括(1)热变性、(2)退火和(3)延伸反应的三个温度步骤的重复循环进行扩增。

在第一个热变性步骤中，模板DNA链从双链离解成单链。用于该热变性的反应温度通常为约94℃。在第二个退火步骤中，寡核苷酸引物结合(退火)至单链模板DNA链。退火温度通常为约50℃至60℃。在第三个延伸反应中，利用该寡核苷酸引物作为起源(origin)，DNA聚合酶合成与单链部分互补的DNA。用于延伸反应的反应温度通常为约72℃。

对于基因表达水平分析和cDNA克隆，使用了RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)，其中mRNA到cDNA中的逆转录反应在PCR之前实施。在RT-PCR中，已广泛使用单步骤RT-PCR，其中在前的逆转录反应和接下来的扩增反应在一系列步骤中实施。

在单步骤RT-PCR方法中，与处于表达分析或被克隆的RNA链(mRNA)互补的DNA链(cDNA)首先通过逆转录反应合成。该反应利用保持在通常约42℃温度下的包含RNA链、逆转录酶和逆转录寡核苷酸引物的反应溶液实施。在接下来的扩增反应中，利用合成的DNA链作为模板实施PCR反应。通常选择用于该扩增反应的引物以在不同于用于逆转录的寡核苷酸引物的结合位点的位点处结合至RNA链(或模板DNA链)碱基序列。

近年来，一种更容易的方法，称为等温扩增，已经被用作能够消除对于重复温度循环的需要的一种核酸扩增方法。例如，在LAMP(环介导等温扩增)中，模板核酸链与诸如寡核苷酸引物、链置换型DNA合成酶和核酸单体的试剂混合，并将该混合物保持在恒定温度(在65℃附近)以进行该反应。

关于本发明，Light-Triggered Polymerase Chain Reaction，Chem.Commun.，2008，462-464描述了一种用于控制PCR反应的技术，其中利用在其碱基序列中包括连接了光可降解保护基团的胸腺嘧啶的寡核苷酸引物。在这种技术中，通过UV射线照射而离解的6-硝基胡椒基氧甲基(6-nitropiperonyloxymethyl)(NPOM)基团用作光可降解保护基团(光降解保护基，photodegradable protecting group)。

发明内容

在等温扩增中也广泛采用在一系列步骤中实施逆转录反应和扩增反应的技术，如在单步骤RT-LAMP的情况下。然而，与PCR不同，LAMP参与在逆转录反应之后在恒定温度下进行的扩增反应。如已知的，单步骤RT-LAMP的一个缺点是较差的逆转录反应效率，其由通过链置换型DNA合成酶进行的扩增反应同时利用由逆转录酶促进的逆转录反应引起。降低的逆转录反应效率降低扩增反应中用作模板的核酸链的量，其结果是基因表达水平分析的准确性或克隆的效率可能会降低。

因此，需要能够改善等温扩增中的逆转录反应的效率的方法，其中逆转录反应和扩增反应在一系列步骤中实施。

本发明的一个实施方式提供了一种核酸等温扩增方法，其包括：(1)实施逆转录反应以将靶RNA链逆转录到模板DNA链中；(2)用光照射反应溶液以离解结合至寡核苷酸引物的序列中的核苷酸的光可降解保护基团；以及(3)对该模板DNA链实施扩增反应。

在本发明实施方式的核酸等温扩增方法中，寡核苷酸引物包括在其序列中的连接了光可降解保护基团的核苷酸，并因此该寡核苷酸引物与互补链的结合在(1)中被所述光可降解保护基团抑制。寡核苷酸引物仅在光可降解保护基团在(2)中离解之后才在(3)中结合至该互补链。

在该核酸等温扩增方法中，优选光可降解保护基团结合至该核苷酸的碱基部分，并且例如使用6-硝基胡椒基氧甲基基团。

扩增反应可以是LAMP。在这种情况下，连接了光可降解保护基团的核苷酸优选包括在寡核苷酸引物的序列中，该寡核苷酸参与使靶RNA链从模板DNA链脱离的同时合成互补DNA链的链置换反应。