[发明专利]检测轮状病毒A组的组合物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种特异性检测病毒的组合物、试剂盒和检测方法。

背景技术

轮状病毒主要感染人体小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻，病程一般为一周左右，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重者出现脱水症状。引起小儿秋冬腹泻的轮状病毒主要属A组，成人轮状病毒多为B组，A、B组形态上无法区分。全世界每年因轮状病毒A组感染导致的婴幼儿死亡的人数大约为90万人，其中大多数发生在发展中国家。在我国， 2岁以内的婴幼儿约为4000万人，每年大约1000万婴幼儿患轮状病毒感染性胃肠炎，占婴幼儿人数的1/4，是引起婴幼儿严重腹泻的最主要病原。

轮状病毒为双链RNA病毒，球形颗粒，直径70nm，结构稳定，耐热，耐酸碱，表面有血凝素，培养较困难。轮状病毒是由粪口路径传播，也有可能经由呼吸路径传染。受感染者每毫克粪便中可以包含上亿个有传染性的病毒颗粒，其中只要10个到100个病毒颗粒就可以具备传播和感染能力。轮状病毒A组在20℃左右活跃，其流行有明显的季节性。儿童多集中在每年10月至12月期间感染轮状病毒，秋冬交接时期尤其要注意谨防小儿感染轮状病毒。

人一生中感染轮状病毒A组的经过大致为：第一次感染通常会产生症状，感染后，免疫系统产生部分的保护机制，故下一次感染通常无症状。童年获得的免疫力使大部分的成人对轮状病毒A组并不易感。两岁以下儿童的感染症状发生比例最高。虽然新生儿感染的机会很常见，但是通常症状温和或是无症状；六个月到两岁的小孩及存在免疫缺陷的小孩的症状最为严重。

轮状病毒A组在婴幼儿之间有很强的传染性和致病性，为了有效的保护患儿和易感儿童，应做到早发现、早隔离、 早诊断、早治疗，这使轮状病毒A组的早期诊断方法显得尤为重要。由于该病毒血清型较多，病毒分离或培养繁杂费时，且费用高，实验条件高，使以往的病原学诊断受到限制。抗原金标法检测敏感度低，假阴性高，细胞培养费时费力，不利于快速检测，并且涉及活的病毒培养，对于操作人员来说具备一定的危险性。近年来针对病毒核酸序列的PCR反应快速检测技术开始出现。对于PCR检测来说，引物的选择至关重要，直接影响检测的特异性。如果引物特异性不够，则可能导致检测的假阳性结果或者假阴性结果的出现。目前，发明一种能特异性检测轮状病毒A组的物质和方法非常紧迫，但是还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的之一在于针对上述存在的问题，提供一种能特异性检测轮状病毒A组的组合物。

本发明采用的技术方案是这样的：一种检测轮状病毒A组的组合物，包括下述引物：

P1：5’- GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC -3’，

P2：5’- AAYTGYGGTATATTCAATACCATACA -3’，其中，Y为C或T。

作为优先：还包括下述探针：

Probe：5’-荧光报告基团AARGAGCTAWCCGYTAGCCAGACGG -荧光淬灭基团-3’，其中 R为A或G，Y为C或T，W为 A或T。发明人针对病毒特异的靶序列设计Taqman探针，用于检测病毒时很大程度上保证了结果的特异性

进一步的：其中所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为ECLIPSE。

本发明的目的之二在于：提供一种能特异性检测轮状病毒A组的试剂盒。

采用的技术方案为：一种检测轮状病毒A组的试剂盒，包括病毒RNA逆转录反应体系、PCR反应体系和上述的组合物。

作为优选：所述PCR反应体系为实时荧光PCR反应体系。

本发明的发明目的之三在于：提供一种能特异性检测轮状病毒A组的方法。

采用的技术方案为：一种检测轮状病毒A组的方法，依次包括以下步骤：

1)    提取样品中的病毒RNA；

2)    使用权利要求1-3中所述的组合物和使用权利要求4或5所述的试剂盒，用PCR法扩增所述病毒相应核酸序列；

3)    反应的结果进行分析：上述步骤（2）实时荧光 PCR反应的结果进行分析，得出检测结论。

作为优选：所述的PCR法为实时荧光PCR法。

进一步的：所述实时荧光PCR反应体系为：反应体系为20μl,包括： 5×PCR缓冲液4 ??l、10mmol/L dNTP 0.8??l、20??mol/L引物各0.4 ??l、10??mol/L 探针各0.4 ??l、QIAGEN逆转录酶和聚合酶混合物0.8??l、模板2ul，加灭菌水至终体系20 ??l。