[发明专利]一种快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及病原微生物的检测与鉴定，具体涉及一种用环介导等温基因扩增技术（LAMP技术）快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法。

背景技术

近年来，非结核分枝杆菌感染明显增加，结核与非结核分枝杆菌在临床上引起的疾病难以区别，最具代表性的结核分枝杆菌引起的结核病酷似非结核分枝杆菌肺病，但两者对抗结核药物敏感性不同，故正确鉴定分枝杆菌在疾病诊断及治疗中至关重要。传统的生物学鉴定方法主要依据细菌生长速度、色素产生、对药物耐受性、生化反应等，方法复杂、费时，在得到分离培养物后仍需2～4周方能获得结果，因此有必要建立一种快速诊断结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法，对结核病确证及临床用药具有重要的指导意义。

目前鉴别结核分枝杆菌的分子生物方法有PCR，ELISA、免疫胶体金等方法，以上各种方法虽然可能在临床上提供较好的价值，但因需要昂贵的仪器设备、繁琐的操作过程、灵敏度低等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。环介导等温基因扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称LAMP法）是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将LAMP法应用于快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。

 

发明内容

本发明的目的在于提供一组用于快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的特异性引物，及一种用环介导等温基因扩增技术（LAMP技术）快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法。本鉴定方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明根据结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌16S RNA的特异性设计4条特异性引物，利用环介导等温扩增技术，在60～65℃，等温扩增60~90分钟，根据显色剂显示的颜色来区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。

用于快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的特异性引物，包括：

内引物1：5’- TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT -3’（SEQ ID No.1）；

内引物2：5’- TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG -3’（SEQ ID No.2）；

外引物1：5’- TCATCGCCGATCATCAGG -3’（SEQ ID No.3）；

外引物2：5’-CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3’（SEQ ID No.4）。

一种快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法，具体包括如下步骤：

（1）模板DNA的提取：提取待检样品的DNA，所述待检样品是已鉴定为含有分枝杆菌的样品或分离的分枝杆菌；

（2）环介导等温基因扩增反应：在200μl PCR管配制反应体系：引物混合液1μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶0.5~1μl，模板DNA 2~5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl，然后加入20μl的密封液，将上述反应管于63~65℃反应60~90min；

所述引物混合液含有上述的4条特异性引物（SEQ ID No.1~4），其中，内引物1的浓度为4~8 pmol/μl、内引物2的浓度为4~8 pmol/μl、外引物1的浓度为1 pmol/μl、外引物2的浓度为1 pmol/μl； 

所述反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄、 5mM Betaine，四者的体积比为7~9：5：2~4：9~11；

（3）结果判断：在上述反应管中加入1~2μl显色剂SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为结核分枝杆菌，橙色则为非结核分枝杆菌。

优选的，所述反应液中，10mM dNTP：10×ThermoPol反应缓冲液：150mM MgSO₄：5mM Betaine（体积比）=8：5：3：10。

优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl。