[发明专利]一种检测乙型肝炎病毒耐药突变的试剂盒

说明书

技术领域

    本发明涉及一种检测乙型肝炎病毒耐药突变的试剂盒，具体涉及一种利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒耐药突变的试剂盒，属于医疗器械领域。

背景技术

乙型肝炎是世界范围内最严重的健康问题之一，全球有约20亿人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV），其中3.5亿人呈慢性感染状态，中国约有1.2亿HBV感染者，乙型肝炎感染是导致肝纤维化、肝衰竭和肝癌的主要原因。病毒产生耐药性是长期困扰乙型肝炎治疗的一大难题，HBV耐药会导致严重的临床后果，临床治疗时需要对HBV耐药性进行密切监测。

目前，我国SFDA 批准的一线抗乙肝药物（核苷类似物），如拉米夫定（LAM）、替比夫定（LdT）、阿德福韦酯（ADV）、恩替卡韦（ETV）都存在不同程度的耐药情况。HBV发生耐药突变后，一方面使疗效降低甚至无效；另一方面会增加患者不必要的经济负担、造成医疗资源的浪费和流行病学危害。因此，通过基因变异检测来快速判断患者耐药与否及对哪种药物耐药，是指导医生用药，实现个体化医疗的前提和依据。

国内外均有大量文献报道了HBV核苷类似物的耐药变异：LAM长期治疗慢性乙肝患者的研究结果显示,YMDD耐药突变的患者的Child-Pugh 评分显著高于未发生YMDD突变的患者，肝病进展程度加剧。HBV逆转录酶YMDD区域的rtM204V（YVDD）或rtM204I（YIDD）变异可直接导致对LAM强耐药。出现拉米夫定耐药时需改变治疗方案，选用ADV继续治疗。与ADV相关的两个主要耐药突变为rtA181V 和rtN236T, 它们与LAM的YMDD突变位点没有重叠，无交叉耐药性。HBV对LdT的耐药发生率虽然低于LAM，但在长期治疗中也不容忽视，并且在HBeAg阳性的患者中发生率更高。在YMDD变异的基础上，rtI169T、rtT184A/G/I/S、rtS202G/I 及rtM250V等进一步变异可形成HBV对ETV的耐药性。以上4种核苷类似物抗病毒药物的耐药位点均在大量临床实践中得以证实，检测这些耐药变异能帮助医生了解患者已发生对哪种药物的耐药，及时换药或联合用药，提高治疗效果。

目前可用于HBV耐药突变检测的方法有探针杂交法、基因芯片法、质谱法、基因测序法等。探针杂交法假阳性率较高；基因芯片法成本高、制备方法繁琐；质谱法难以在普通医疗机构开展；而基因测序法敏感性和特异性均高，操作相对简便，可高通量完成临床样品检测。

目前尚无文献报道利用基因测序技术进行HBV全基因序列分析耐药突变检测的试剂盒。

 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测乙型肝炎病毒耐药突变的试剂盒。

本发明利用基因测序技术，先设计了HBV DNA Pol基因 RT区扩增引物：

HBV DNA Pol基因上游引物序列为：5’-CTGCTGGTGGCTCCAGTT-3’

HBV DNA Pol基因下游引物序列为：5’-GAGTTCCGCAGTATGGATCG-3’

本发明提供的利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒耐药突变的试剂盒，包括HBV DNA Pol基因区域扩增引物、HBV DNA提取试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液和PCR测序试剂，其中，

HBV DNA Pol基因上游引物序列为：

5’-CTGCTGGTGGCTCCAGTT-3’（SEQ ID No.1）

HBV DNA Pol基因下游引物序列为：

5’-GAGTTCCGCAGTATGGATCG-3’（SEQ ID No.2)

其中HBV DNA提取试剂为：pH 8.0的10mmol/L Tris-HCl、 5mmol/L EDTA、0.5%(g/ml)十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate, SDS)和150μg/ml蛋白酶K。

其中阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有已知型别的HBV样品为阳性对照。

其中的PCR反应液包括：10×PCR混合液、0.25 pmol/μL的引物、2.5-4.0 mM的MgCl₂、2U的Taq酶、0.2~0.4 mM的dNTPs、0.3~0.6 mM dUTP，取1~2 μl的模板。

其中PCR测序反应液包括：4 μL测序缓冲液，1 μL DNA模板，1 μL测序引物。