[发明专利]转基因水稻品系克螟稻PCR-DHPLC检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因产品的检测，特别是涉及一种转基因水稻品系的PCR-DHPLC检测引物及检测方法。 

背景技术

目前对转基因水稻的检测方法主要采用常规PCR、实时荧光PCR、PCR-基因芯片等检测方法。传统的常规PCR检测方法在平台扩展方面具有一定的局限性，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大；另一方面，通常采用的凝胶电泳分析扩增产物的方法，区分效率不高，检测结果不理想。实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较多重常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展。常规的多套PCR-基因芯片检测方法，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。变性高效液相色谱技术(Denaturing High-performance Liquid Chromatography，DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，具有扩展性强、分辨率好、灵敏度高等优点。该方法在50℃条件下分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定洗脱顺序，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。通过得到的洗脱峰与marker比较确定分子量大小，判定是否含有目标检测基因。目前，尚没有转基因水稻品系克螟稻的PCR结合DHPLC的检测技术(PCR-DHPLC)。 

发明内容

本发明的目的是提供一种用于转基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC检测的引物。 

本发明的另一目的是提供一种基于上述引物的扩展性能好、灵敏度和分辨率高的转基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC检测方法。 

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案： 

本发明公开了用于转基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC检测的引物，所述引物的上游引物含有Seq ID No.1所示序列，下游引物含有Seq ID No.2所示序列； 

Seq ID No.1：5’-CTTTTCTGGCTGTCTCGGCT-3’ 

Seq ID No.2：5’-AGGCGGTGAAGGGCAATC-3’。 

需要指出的是，上述Seq ID No.1和Seq ID No.2是与转基因水稻品系克螟稻的检测靶标序列互补配对的特异序列，具有很强的特异性识别性。 

进一步的，所述上游引物的5’端还包括Seq ID No.3所示序列，所述下游引物的5’端还包括Seq ID No.4所示序列； 

Seq ID No.3：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’ 

Seq ID No.4：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3’。 

需要指出的是，上述Seq ID No.3和Seq ID No.4是分别在上游引物和下游引物的5’端添加的与检测靶标序列无关的一段序列，该序列可以是与检测靶标序列同源性很远的其它物种的序列，也可以是一段随机生成的序列。该序列可以用于调控PCR扩增产物的大小，以便于PCR扩增产物的进一步分析。 

本发明中，优选的，所述上游引物具有Seq ID No.5所示序列，下游引物具有Seq ID No.6所示序列； 

Seq ID No.5：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACTCTTTTCTGGCTGTCTCGGCT-3’ 

Seq ID No.6：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAAGGCGGTGAAGGGCAATC-3’。 

需要说明的是，所述Seq ID No.5和Seq ID No.6序列是由上述Seq ID No.1和Seq ID No.2序列分别在其5’端添加调控序列而成，尽管上述已经说明Seq ID No.3和Seq ID No.4所示调控序列可以是随机生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具体到本发明中，需要考虑调控序列与Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列的理化性质的统一协调，并且还需要考虑添加调控序列后的Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列作为检测引物的整体性能。 

本发明还公开了一种用于转基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC检测方法，所述检测方法包括采用上述引物，以水稻DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行变性高效液相色谱分析。