[发明专利]鲫肝细胞原代培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的鲫肝细胞原代培养方法，属于细胞生物学及生物技术学领域。

背景技术

肝脏是机体的主要解毒器官，是许多毒物损伤的靶器官，同时也是体内化学物代谢的重要器官。体内复杂多变的环境对在体研究化学物引起肝脏损伤带来一定的难度，原代培养细胞离体时间短，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反应体内状态，利用原代培养细胞生理生化及遗传特性稳定性，研究化学物的毒性及肝细胞对毒物的应答及解毒机制。

鱼类是生活在水体中的脊椎动物，是用来检测水体污染物良好的生物指示体。原代培养的肝细胞较好地保留及维持了肝细胞的完整性和代谢活性，可真实地反应体内代谢情况。同时，肝细胞是外源化学物转化及代谢的重要场所，也是外源物质造成化学和生物损伤的主要作用靶点。因此体外肝细胞在研究化学物生物转化和毒性作用机制方面有着许多优势，是研究体外毒性的理想模型。鱼类培养的细胞作为实验对象，有着活体鱼无法比拟的优点：（1）实验材料成本低，细胞的维护不需要大量的换水、充气和养殖设备；（2）重复性好，实验条件可以精确控制，对细胞进行深入研究，无论在理论研究方面，还是在实际应用方面，都有着深远意义。鲫是我国重要的食用鱼，在我国水产市场占有重要地位，以鲫鱼作为实验对象，不论从市场经济上和科学研究都有强大的推动作用。

肝实质由大量肝细胞为主组成，含间质少，肝细胞具有多种功能，代谢旺盛，在体外所需条件高。《中国比较医学杂志》，2006年14卷3期，在剑尾鱼肝组织块培养方法中，对组织块消毒采用的是70%乙醇浸泡30s，实验提及浸泡时间应严格控制在30S内，过长的时间会影响组织活性，降低细胞贴壁能力和存活率。相对于乙醇，洗必泰更适合用于组织块的消毒。

目前虽然有一些分离和鉴定肝细胞的方法，然而分离的肝细胞纯度比较低，活性相对较低。本实验对已有的细胞培养方法进行改良、借鉴，欲通过建立较高纯度的肝细胞培养方法，为研究环境污染对鲫肝细胞的毒害及致毒机制提供良好的实验模型。我们在模型建立中发现，从组织分离到细胞获取，中间有3个关键因素：1.无菌培养；2.消化过程；3.细胞生长的贴壁程度，这三个因素会决定细胞的生长状态，影响着后续试验的开展。

发明内容

本发明的目的是为了在鲫肝细胞原代培养方法中得到纯度和活性相对较高的肝细胞。

在对已有的细胞培养方法进行改良、借鉴的基础上，本发明提供了一种鲫肝细胞原代培养方法，它包括以下工艺步骤：

a、 从健康的鲫中分离肝组织

首先剪断其鳃部脉弓，放血处死，用酒精擦拭鲫体表进行消毒，在超净工作台内解剖鲫，并取出肝组织，将分离的肝组织浸泡于葡萄糖洗必泰中10min；

b、  采用分步消化法对剪碎的肝组织进行消化获得细胞团

将浸泡过葡萄糖洗必泰的组织用D-hank’s漂洗2次，剪碎成2-3mm³的组织块；为了提高消化效果采用分步消化法消化组织：

将剪碎的组织倒入离心管，置入28℃的水浴锅内；首先加入组织量4-5倍体积的胰蛋白酶和EDTA消化，期间不停摇匀，15min消化完毕后，离心弃上清。加入3ml的D-hank’s同底部沉淀混匀后离心弃上清，将残留的胰蛋白酶和EDTA去除，终止消化；

向所得沉淀组织中加3-4倍体积的Ⅱ型胶原蛋白酶和CaCl₂置入28℃水浴锅，期间不停摇匀，每隔10min后取出3/4的上清液移入另一个离心管；在烧杯中添加新的Ⅱ型胶原蛋白酶和CaCl₂继续消化组织块；

30min消化完毕后，将收集的上清液细胞悬液通过200目孔径不锈钢滤网，滤掉组织块；离心弃上清，加入3ml的无血清培养基同底部沉淀混匀后离心弃上清，将残留的Ⅱ型胶原蛋白酶和CaCl₂去除，终止消化；

c. 对获得的细胞团进行纯化和培养

      ①使用红细胞裂解液去除血细胞：向离心管中加10ml D-hank’s，将沉淀细胞团用移液器吹打分散成单个细胞悬液，同时加1ml的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，上下颠倒6-8次，静置5min；离心倒弃红色部分，留下管底白色细胞团；加D-hank’s同白色细胞团混匀，吹打并离心，溶解于3ml的D-hank’s配成肝细胞悬液；

②加Percoll试剂对分离的肝细胞纯化：取肝细胞悬液悬浮于2.5倍体积的Percoll分离液Ⅱ上，离心弃上清；取沉淀细胞团用5ml的D-hank’s重悬，枪头吹打混匀；1500rpm，5min离心，弃上清，得到纯化过后的肝细胞；