[发明专利]水稻金属离子转运蛋白及其编码基因和在重金属吸收转运方面的应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及水稻金属离子转运蛋白及其编码基因和在重金属吸收转运方面的应用。

背景技术：

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是发酵生物工程中的常用菌株，在食品及轻工业行业中有较为广泛的应用。酿酒酵母不仅是白酒、葡萄酒和啤酒等酒饮料的生产过程中必须生产环节(李筝等，优良酿酒酵母菌的发酵性能研究。中国酿造。2008。19：10-12)，更被用作饲料和食品(保健品)添加剂(王鹏银等，酿酒酵母源饲料添加剂的研究与应用。饲料工业。2011。32(2)：30-35；李沛等，安琪酵母抽提物及其在食品调味品中的应用。中国酿造。2010。215：17-21)。在发酵生物工程中，获得优质的酵母菌株往往是生产的关键环节。传统的筛选优质酵母菌株的方法主要是通过自然筛选、诱变育种和杂交育种等方法来进行选育(马福荣等，富钼酿酒酵母菌株的选育及其生物学功能研究。山东农业科学。2008。6：63-69)，随着基因工程的发展，人们在利用基因工程改良酵母菌株的研究中也取得了良好的进展，并已逐渐成为基因改良的主流(韩北忠等，葡萄酒酿酒酵母菌基因工程改良。中国酿造。2007。5：1-6)。

随着工业的发展和人类活动范围的拓展，重金属污染已经影响到人类社会生活的方方面面。其中重金属引发的食品安全问题尤其引起人们的关注。酵母菌株无论是应用于发酵生物工程，还是应用于饲料和食品(保健品)添加，重金属的含量已成为衡量是否为优质酵母菌株的标准之一。1995年发布的《中华人民共和国轻工行业标准》中对酿酒活性干酵母卫生要求中，限定重金属含量(以Pb计)应小于20mg/kg。因此，降低酿酒酵母中的重金属含量也是改良酿酒酵母工程菌株一个重要指标。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种水稻金属离子转运蛋白OsMTP11及其编码基因OsMTP11。

本发明的水稻金属离子转运蛋白OsMTP11，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因OsMTP11的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。

本发明的第二个目的是提供一种含有水稻金属离子转运蛋白基因OsMTP11的重组表达载体。

所述的表达载体优选为表达载体pYES260(如图1所示)。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述重组表达载体的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

本发明的第四个目的是提供水稻金属离子转运蛋白基因OsMTP11在重金属吸收和转运方面的应用。

本发明以水稻幼苗叶片为材料，提取其总RNA，再将mRNA反转录成cDNA，以该逆转录产物为模板设计引物进行PCR扩增，获得1.3kb的片段。采用琼脂糖凝胶电泳回收片段，连接于pGEMT载体上，测序分析，该序列包含一个开放阅读框，为1248个碱基，其序列如SEQ ID NO.1所示，将此基因命名为OsMTP11，其编码蛋白具有415个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为OsMTP11。再将OsMTP11基因连入酵母表达载体pYES260中，再用醋酸锂法将含有OsMTP11基因的表达载体pYES260转入酿酒酵母菌BY4741中，再在含有0.1mM Mn，0.2mM Co，0.2mM Ni和3mM Zn的培养基中培养，然后用原子吸收光谱的方法测定酿酒酵母菌中四种重金属离子的含量，结果发现转有含有OsMTP11基因的表达载体pYES260的酿酒酵母菌BY4741中的Mn，Co，Ni和Zn四种金属离子的含量低于野生型酿酒酵母株系，其中的Ni离子含量达到显著性差异。

将OsMTP11基因编码的蛋白质在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中采用BlastP程序进行序列比对之后，发现该蛋白与拟南芥中的金属离子转运蛋白AtMTP11具有较高的序列同源性，其氨基酸序列一致性达到75.66％。序列分析结果再结合上述实验结果表明，本发明的OsMTP11基因是水稻金属离子转运蛋白基因，其编码的蛋白是水稻金属离子转运蛋白。

因此可以将本发明的OsMTP11基因应用到重金属吸收和转运方面中。本发明的OsMTP11基因与表达载体连接，再转入宿主细胞中，如酿酒酵母中，能降低宿主细胞中的金属离子含量。