[发明专利]荧光强度补偿方法及荧光强度计算装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光强度补偿方法及荧光强度计算装置，更具体地，涉及一种用于精确地计算从微粒上多重标记的多种荧光染料的每一种发出的荧光的强度的荧光强度控制方法。

背景技术

为了测量诸如细胞的微粒的特性，现有装置(如流式细胞仪)使用荧光染料标记微粒、向荧光染料照射激光束以激发荧光染料以及测量由激发的荧光染料发出的荧光的强度或图谱(pattern)。近年来，为了更精确地分析例如细胞的特性，使用其中用多种荧光染料标记微粒并使用具有不同接收光波段的多个光检测器(如PD(光电二极管)或PMT(光电倍增管)测量从荧光染料发出的激光束的多色法测量。在多色法测量中，为了检测荧光，根据所使用的荧光染料的荧光波长为光检测器选取一个滤光片。

然而，当前使用的荧光染料(如FITC(异硫氰酸荧光素))或PE(藻红蛋白)在荧光光谱中具有重叠的频段。因此，在使用这些荧光染料的组合进行多色法测量的情况下，即使使用滤光片将从各荧光染料发出的荧光分离为不同的频段，光检测器仍可检测到从不想要的荧光染料中漏入(spillover)的荧光。如果发生荧光漏入，则光检测器检测到的荧光强度偏离从期望的荧光染料发出的荧光的真实强度。因此，产生测量误差。

为了补偿测量误差，通过从由光检测器测出的荧光强度减去漏入的荧光的强度来执行荧光补偿。通过以电的方式或数学的方式补偿脉冲来执行荧光补偿，使得由光检测器测出的荧光强度变为期望荧光的真实荧光强度。

一种以数学方式补偿荧光强度的方法，是通过将由光检测器测出的荧光强度(检测值)定义为向量并将预定的漏入矩阵的逆矩阵作用于该向量来执行。以此方式，可算出从期望的荧光染料发出的荧光的真实强度(参照图3和图4，及日本未审查专利申请公开第2003-83894号)。通过分析被单标记的各微粒的荧光波长分布来生成漏入矩阵。在漏入矩阵中，各荧光染料的荧光波长分布被表示为列向量，并对这些列向量进行排列。漏入矩阵的逆矩阵也被称作“补偿矩阵”。在图3和图4中，示出了使用五种荧光染料(FITC、PE、ECD、PC5和PC7)和五个光检测器进行五色法测量的示例。

发明内容

在使用补偿矩阵对荧光强度进行补偿的方法中，允许负值用作矩阵的元素。因此，补偿的荧光强度可以为负。这是因为包含在各光检测器的检测值中的噪声会影响矩阵元素的值。然而，实际上，从各荧光染料发出的荧光的强度不为负。此外，如果从一种荧光染料发出的荧光的强度被计算为负值，则从其它荧光染料发出的荧光的强度的计算值在正方向上出现误差。

如果在要分析的微粒群中存在一种荧光染料的荧光强度为负的子群，则在二维相关图(细胞直方图)中不绘出该子群，其中在二维相关图中荧光染料的荧光强度标绘在对数轴上(具有对数尺度)。因此，用户可能误解二维相关图上标绘的群少于实际的群。

此外，在现有的荧光强度补偿方法中，在将从微粒发出的自身荧光的强度的检测值当作背景值并从各光检测器的检测值中减去自身荧光的强度时，将整个群的自身荧光强度的平均值用于计算。然而，子群与子群间的自身荧光的强度和图谱是不同的。因此，从所有群的每一个中减去相同平均值的计算引起荧光强度的计算值误差。具体地，如果要分析的子群间的自身荧光差异显著，则误差增加。

因此，本发明提供了一种在使用多个光检测器对用多种荧光染料多重标记的微粒进行多色法测量时，精确地计算从各荧光染料发出的荧光的强度并向用户呈现算得的强度的技术。

根据本发明的实施方式，一种荧光强度补偿方法包括：向用荧光波段彼此重叠的多种荧光染料多重标记的微粒照射光、激发荧光染料并使用具有不同接收波段的光检测器接收由激发的荧光染料产生的荧光；以及通过在对算得的荧光强度赋予预定限制条件下补偿所述光检测器的检测值来计算所述荧光染料的荧光强度。

在计算荧光强度过程中，可通过使用从标记有一种荧光染料的微粒获得的单染色光谱和从未标记任何一种荧光染料的微粒获得的自身荧光光谱的线性和对测量光谱进行近似来计算各荧光染料的荧光强度和自身荧光强度，该测量光谱是通过收集各光检测器的检测值所获得的。通过在考虑微粒自身荧光成分时执行计算，可精确地计算子群间相互不同的自身荧光成分，因此，可避免由子群之间的自身荧光强度不同引起的测量误差。