[发明专利]烷基磷酸试剂在酶抑制法检测农产品中有机磷农药的应用

权利要求书

1.一类烷基磷酸试剂在酶抑制法测定农产品中有机磷农药的应用，其特征是所述的烷基磷酸试剂具有如下的结构式：

R＝n-C_nH_2n+1，n＝6-18。

2.如权利要求1所述的烷基磷酸试剂的应用，其特征是通过下述步骤用酶抑制法测定农产品中有机磷类农药残留量：1)农产品样本的提取溶解；2)烷基磷酸试剂作用于乙酰胆碱酯酶；3)将样品提取物作为抑制剂，作用于乙酰胆碱酯酶，另一份酶反应用同体积水作为空白对照组；4)加入底物硫代乙酰胆碱，进行酶的水解反应，考察酶的活性，并淬灭与基质混合，进入MALDI-FTMS分析。

如权利要求2所述的应用，其特征是通过以下步骤进行：

1)经提取农产品后的样品溶液，取上层1000μL，离心后取上层清液500μL，氮气吹干，并用相同体积超纯水溶解；

2)以10％氢氧化钠溶液将烷基磷酸试剂中和至pH＝7.0-8.0，平行两份：乙酰胆碱酯酶加入等体积烷基磷酸试剂，酶浓度与烷基磷酸试剂浓度比为1∶500-1500；

3)步骤1)所得的样品溶液离心后取上层，加入其中一份步骤2)的酶反应体系中进行反应5-30min；同时另一份2)体系中加入同体积的超纯水作为空白对照；

4)在步骤3)的溶液中加入与抑制剂等体积的底物硫代乙酰胆碱，37℃反应5-30min，加入乙腈淬灭酶反应，最后加入与最终反应液等体积的基质溶液充分混合，进行基质辅助激光解吸离子化-傅立叶变换离子回旋共振质谱分析，样品中酶水解底物和产物的比例由质谱中峰强度的比例表示，对酶活性进行检测：转化率＝产物/(产物+未反应的底物)，其中未反应的底物包含底物峰及底物碎片峰，抑制率I＝(C₀-C_t)/C₀，C₀为不加入农产品样本的空白体系的酶反应转化率，C_t为农产品样本参与的酶反应体系转化率。

3.如权利要求3所述的应用，其特征是步骤1)将提取液的溶剂替换为超纯水，排除有机溶剂对酶活性的影响；步骤2)烷基磷酸试剂作用于乙酰胆碱酯酶，引起酶结构的变化；3)将样品提取物作为抑制剂，作用于乙酰胆碱酯酶，同时不加抑制剂的作为空白对照组；4)加入底物，进行酶的水解反应，考察酶的活性，并淬灭与基质混合，做基质辅助激光解吸离子化-傅立叶变换离子回旋共振质谱分析。

4.如权利要求1所述的应用，其特征是所述的有机磷农药为三唑磷、甲胺磷、对硫磷、乙酰甲胺磷、敌百虫或乐果。

5.如权利要求3所述的应用，其特征是所述的乙酰胆碱酯酶和底物硫代乙酰胆碱溶液均用三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH＝8.0的缓冲溶液配制。

6.如权利要求3所述的应用，其特征是所述的经提取农产品后的样品溶液：农产品样品1g，加入5mL分析纯丙酮，0.1g氯化钠，0.4g氯化镁，振荡5分钟，取上层1mL离心，再取上层清液，氮气吹干后用相同体积水溶解，再离心，上层清液作为最后参与酶反应溶液。

7.如权利要求3所述的应用，其特征是所述的乙酰胆碱酯酶水解底物硫代乙酰胆碱的过程如下：

8.如权利要求3所述的应用，其特征是所述的基质溶液的制备过程如下：50mg基质2，5-二羟基苯甲酸用500μL甲醇溶解，并加入0.1％V/V三氟乙酸，再与等体积的甘油水溶液混合，甘油/水＝60∶40，V/V。