[发明专利]两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋鱼类与蟹类抗菌肽的基因工程表达，具体涉及具有抗菌活性的拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin与大黄鱼抗菌肽Hepcidin在毕赤酵母GS115中的真核融合表达产物及制备方法。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptide)是先天性免疫的重要组分，广泛存在于生物界的各个门类，进化上相对保守，具有广谱的抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用。研究、开发与应用抗菌肽对解决海水养殖生产中面临的细菌耐药性和饲料中滥用抗生素造成的水产品药物残留及水环境污染等问题具有重要的科学意义和实际应用价值。从抗菌肽的未来开发应用角度而言，优化多种抗菌肽的重要抗菌结构域并重组表达，可获得新型的融合抗菌多肽，拓宽抗菌肽的抗菌谱，可能比单纯利用某一种抗菌肽具有更重要的实际应用价值。

拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin与大黄鱼抗菌肽Hepcidin均来源于海洋动物，且Scygonadin来自于无脊椎动物，在先天性免疫中发挥作用。而Hepcidin来自于低等脊椎动物，是鱼类先天免疫重要的效应因子。迄今，还未有关于这两种类型抗菌肽串联表达的研究报道。

Hepcidin是一种富含半胱氨酸的两性分子，可以通过二硫键形成稳定的β折叠结构和Loop结构，这种结构与Hepcidin的抗菌活性密切相关([1]Hunter H N，Fulton D B，Ganz T，Vogel H J.The solution structure of human hepcidin，a peptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis[J].J Biol Chem.，2002，277(40)：37597-37603)。在大肠杆菌原核表达体系中重组表达的Hepcidin很可能因为二硫键无法正确折叠加工而影响了Hepcidin的抗菌活性，进而影响了联合多肽Scy-hepc的抗菌功能。因而本实验使用毕赤酵母真核表达系统表达Scygonadin和Hepcidin的串联多肽Scy-hepc。

通过基因工程技术构建了Scygonadin基因及与大黄鱼抗菌肽Hepcidin基因联合的真核稳定表达菌株，优化其表达与纯化工艺，研究其基因表达产物的抗菌活性和抗菌谱，将为未来联合多肽产品的应用奠定基础，并为抗菌肽的产业化提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物及制备方法。

所述两种海洋动物抗菌肽基因包括拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因、连接肽和大黄鱼抗菌肽hepcidin基因；所述两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物可命名为Scy-hepc，所述拟穴青蟹阴离子抗菌肽scygonadin基因序列为：

ggccaggcac tcaacaaact tatgcctaaa atcgtcagcg ccataattta tatggtcggg     60

caacccaatg caggtgtcac ttttctgggc caccaatgtc tggtggagtc aacgaggcaa    120

ccagacgggt tttacaccgc aaagatgtcg tgtgcttcct ggactcatga taatcctatt    180

gttggggaag gaagaagccg ggttgaactt gaggcgctta aaggttccat cacaaacttt    240

gtccagacag catccaatta caagaagttc accatagatg aggtcgagga ctggattgct    300

tcttac                                                               306

所述大黄鱼抗菌肽hepcidin基因序列为：

gtcccagcca atgaagagca agagctggag cagcaaattt attttgctga tccagagatg     60

ccagtggaat catgcaagat gccgtattac atgcgtgaga atcgtcaggg cagccctgct    120