[发明专利]革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列

权利要求书

1.一种革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列，其特征是：

2.根据权利要求1所述的革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列，这两对引物不仅可作为革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时内参基因(18S rRNA)的扩增引物，而且可作为革胡子鲶所有待检目标基因表达qPCR分析时，以18S rRNA为内参基因的扩增引物。

3.根据权利要求1所述的革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列，这两对引物不仅可应用于革胡子鲶的研究，还可应用于其它一些鲶形目鱼类的待检目标基因表达qPCR分析时以18S rRNA作为内参基因的研究。

4.革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时用于内参基因(18S rRNA)扩增的两对引物核苷酸序列的制作方法：

一、总体RNA的提取

应用Trizol试剂提取单个垂体的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测，分析其完整性和纯度。琼脂糖凝胶电泳结果显示RNA样本的28S/18S rRNA的条带亮度的比值在1～2之间，提示RNA样本的完整性较好；分光光度计检测两个RNA样本的OD_260/OD280和OD_260/OD230的比值分别为1.89和1.99以及1.96和2.00，即两个RNA样本的OD_260/OD280和OD_260/OD230的比值均在1.8～2.0之间。表明这两个RNA样本没有蛋白和酚的污染，均可用于qPCR实验。

二、RNA的反转录

将上述1个RNA样本反转录成cDNA第一条链(RevertAid^TM cDNA第一条链合成试剂盒)，用于所设计引物的评估。

三、引物的设计与常规PCR评估

1).GH、18S rRNA和beta-actin基因片段扩增引物的设计

本试验中待检目标基因为GH，拟用18S rRNA或beta-actin作为内参基因。GH基因扩增引物根据本实验室克隆的革胡子鲶GH全长cDNA(GenBank检索号：FJ823972)、18S rRNA和beta-actin基因的扩增引物分别根据GenBank检索的18S rRNA(GenBank检索号：AJ876383)和beta-actin(GenBank检索号：HM768299)序列，应用软件Primer 5.0设计。根据qPCR引物设计的基本原则，从设计的数十对引物中预选出GH、18S rRNA和beta-actin扩增的引物各2对，并由上海生工生物工程有限公司合成；其引物信息如下表。

2).引物的常规PCR评估

首先，以稀释10倍的cDNA为模板，根据合成的6对引物的Tm值，进行常规PCR扩增，以便对引物进行初步评估。6对引物的常规PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：6对引物的扩增产物电泳带纹清晰，片段大小与引物设计时产生的片段大小相符，因此进一步对6对引物进行qPCR评估分析。

四、引物的qPCR评估

应用美国BioRad公司IQ^TM5 qPCR仪和该公司的SsoFast EvaGreen qPCR预混液，根据该预混液的说明书，对设计的6对引物进行qPCR评估。

1).引物的qPCR初步评估

以稀释10倍的cDNA为模板，应用与常规PCR相同的退火温度，对GH、18S rRNA和beta-actin基因片段进行qPCR，每个反应做2个平行。结果显示：每对引物在qPCR扩增时得到的熔解曲线均表现为一个峰，说明引物在qPCR扩增中特异性强，满足qPCR的基本要求之一。但是，根据每对引物qPCR的C_T值(见下表)，有3对引物，即：q-GH F1和q-GH R1、q-actin-F1和q-actin-R1以及q-actin-F2和q-actin-R2，在qPCR中的C_T较大，平均值分别为22.93、26.03和26.21，均大于20，说明该浓度的cDNA或者即使是反转录的cDNA原液也不能作为制备标准曲线时的最低浓度样本，即无法应用标准曲线对这3对引物的扩增效率进行评估，所以它们不能用于后续的qPCR分析。根据上述结果，仅对q-GH F和q-GH R、q-18S F1和q-18S R1以及q-18S F4和q-18S R4这3对引物进行进一步的qPCR评估。

2).引物的退火温度及熔解曲线分析

以稀释10倍的cDNA为模板，设置3个退火温度、应用q-GHF和q-GHR、q-18S F1和q-18S R1以及q-18S F4和q-18S R4分别对GH和18S rRNA的基因片段进行qPCR扩增；每个反应做2个平行。结果显示3对引物在退火温度为58℃、60℃和62℃扩增时每个反应的熔解曲线均为一个峰，进一步说明了引物的特异性强，即相应的DNA片段在qPCR中为特异性扩增。3对引物qPCR的C_T值数据(下表)显示：3对引物在3个退火温度下C_T变化不大，表明可选择任一退火温度，通过建立标准曲线，进一步评估这3对引物的扩增效率。

3).引物扩增效率的评估(标准曲线的建立)

(1)引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段的扩增效率评估

以稀释10倍的cDNA作为初始浓度，采用10倍稀释法，共设置5个浓度，以60℃作为退火温度，应用引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段，每个反应做3个平行。

qPCR理想的引物扩增效率应在90～105％之间，标准曲线的R²值应大于0.98，重复样本C_T值的标准差应≤0.50，在指数扩增区相邻的扩增曲线间距应相似。

本部分试验结果显示：在指数扩增区，相邻扩增曲线的间距相似，每个反应的熔解曲线均为1个峰，通过下表显示的数据(每个反应的C_T值、重复样本C_T值的标准差、引物的扩增效率以及标准曲线的R²值)可以看出：该对引物的扩增效率为103.8％，标准曲线的R²值为0.999，重复样本C_T值的标准差在0.068～0.260。因此，根据引物的扩增曲线、熔解曲线、引物的扩增效率和标准曲线的R²值，证明该对引物可用于对GH基因表达的qPCR研究。

注：反应管号中数字相同者代表平行试验。

(2)引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段的扩增效率评估

与GH片段的扩增效率评估相同，以稀释10倍的cDNA作为初始浓度，采用10倍稀释法，共设置5个浓度，以60℃作为退火温度，应用引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段，每个反应做3个平行。结果显示：在指数扩增区，相邻扩增曲线的间距相似，每个反应的熔解曲线均为1个峰，通过下表显示的数据(每个反应的C_T值、重复样本C_T值的标准差、引物的扩增效率以及标准曲线的R²值)可以看出：该对引物的扩增效率为92.4％，标准曲线的R²值为0.999，重复样本C_T值的标准差在0.056～0.300。同理，证明该引物可用于GH表达qPCR分析时，对内参基因(18S rRNA)的扩增。

注：反应管号中数字相同者代表平行试验。

(3)引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段的扩增效率评估

与前2对引物扩增效率的评估相同，以稀释10倍的cDNA作为初始浓度，采用10倍稀释法，共设置5个浓度，以60℃作为退火温度，应用引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段，每个反应做2个平行。结果显示：在指数扩增区，相邻扩增曲线的间距相似，每个反应的熔解曲线均为1个峰，通过下表显示的数据(每个反应的C_T值、重复样本C_T值的标准差、引物的扩增效率以及标准曲线的R²值)可以看出：该对引物的扩增效率为104.2％，标准曲线的R²值为0.998，重复样本C_T值的标准差在0.010～0.280。因此，说明该引物也可用于GH表达qPCR分析时，对内参基因(18S rRNA)的扩增。

注：反应管号中数字相同者代表平行试验。

五、引物的q-GH F和q-GH R以及q-18S F4和q-18S R4扩增片段的测序验证

1).q-GH F和q-GH R扩增GH片段的测序验证

将该对引物的常规PCR产物直接用扩增引物双向测序和拼接(北京六合华大基因科技股份有限公司)，结果如下(其中加粗字体分别为引物q-GH F序列以及q-GHR的反向互补序列)。这一序列与引物设计时产生的扩增子序列100％相同。

CATATCTCTGAAAAGCTGGCTGACCTGAAAATGGGCATCGGTGTGCTTATTGAGGGATGTGTGGATGGACAAACCAGCCTGGACGAGAATGACGCATTTGCTCCGCCCTTCGAGGATTTCTACCAGACCCTGAGCGAGGGGAACTTGAGGAAGAGCT

2).q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段的测序验证

将该对引物的常规PCR产物直接用扩增引物双向测序和拼接(北京六合华大基因科技股份有限公司)，结果如下(其中加粗字体分别为引物q-18S F4序列以及q-18S R4的反向互补序列)。这一序列与引物设计时产生的扩增子序列100％相同。

GAGCTAGGAATAATGGAATAGGACTCCGGTTCTATTTTGTGGGTTTTCGGAACCAGGGCCATGATTAAGAGGGACGGCCGGGGGCATTCGTATTGCGCCGCTAGAGGTGAAATTCTTGGACCGGCGCA

3).q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段的测序分析

由于该对引物扩增的18S rRNA片段仅为83bp，PCR产物无法直接测序，根据引物设计时，该对引物在18S rRNA中的位置，其序列如下(其中加粗字体分别为引物q-18S F1序列以及q-18S R1的反向互补序列)：

GGGGAGGTAGTGACGAAAAATAACGATACAGGTCTCTTTCGAGGCCC

六、引物和扩增子核苷酸序列的GenBank比对

将3对引物，即：q-GH F和q-GH R、q-18S F4和q-18S R4、q-18S F1和q-18S R1以及它们产生的3条扩增子序列分别输入GenBank比对。推测：引物q-GH F和q-GH R不仅可以用于革胡子鲶GH基因片段的qPCR，还可用于蟾胡鲶(Clarias batrachus)。q-18S F1和q-18S R1不仅可以用于革胡子鲶的18S rRNA的qPCR扩增，还可用于20余种鲶形目鱼类，其中包括我国重要的鲶形目养殖鱼类：鲶(Silurus asotus)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)和斑点叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)。而q-18S F4和q-18S R4不仅可以用于革胡子鲶的18S rRNA的qPCR扩增，也可用于多种鲶形目的胡鲶科鱼类，如：杜氏胡鲶(Clarias dussumieri)、钝齿胡鲶(Clarias ngamensis)和大须胡鲶(Clarias buthupogon)等。