[发明专利]氯代脂肪烃降解性质粒pRC11、工程菌及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种氯代脂肪烃降解性质粒pRC11、含有该质粒的基因工程菌，以及该工程菌在微生物降解卤代烃类污染物中的应用。

(二)背景技术

细菌降解性质粒在有机污染物微生物降解过程中起重要作用，它们编码了一些降解过程中的关键酶类，赋予细菌分解代谢各种复杂有机化合物的能力。迄今已报道的卤代烃降解性质粒主要以氯代芳香族化合物降解性质粒为多，如氯代苯甲酸降解质粒Pac25、Pac27和Pwr1，以及2，4-二氯苯氧基乙酸降解质粒pJP4，pEML159和pRC10等。国内关于有机污染物降解性质粒的研究工作开展得比较晚，在80年代末才陆续有一些报道。

迄今尚没有氯代脂肪烃降解性质粒的报道。

(三)发明内容

本发明目的是为了提供一种氯代脂肪烃降解性质粒——pRC11、含有该质粒的基因工程菌及其在微生物分解处理氯代有机污染物中的应用。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种氯代脂肪烃降解性质粒pRC11，其物理图谱见图3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明质粒从实验室自行建成的工业废气生物净化微生物资源菌种库中筛选获得，命名为pRC11。

本发明还涉及含有所述质粒pRC11的基因工程菌。

本发明还涉及所述基因工程菌在微生物降解卤代烃污染物中的应用。

具体的，所述卤代烃污染物优选为下列之一：CH₂Cl₂、CH₂BrCl、C₂H₄Cl₂或C₂H₂Cl₂。

优选的，所述降解在28～32℃、pH6.8～7.2下进行。

本发明提供了一种卤代脂肪烃降解性质粒pRC11，并建立了质粒的物理图谱，对今后利用该质粒进行分子育种，培育高效多功能质粒菌，消除有关物质的环境污染创造了条件。

本发明的有益效果主要体现在：提供一种氯代脂肪烃降解性质粒——pRC11，建立了质粒的物理图谱，该质粒遗传背景非常清晰，可利用该质粒进行分子育种，培育高效多功能质粒菌，提高以二氯甲烷为代表的卤代烃类有机污染物的生物降解效果，大幅度提高有机废气的处理能力。

(四)附图说明

图1为氯代脂肪烃降解性质粒——pRC11电泳检测图谱；

图2为质粒pRC11利用Bam HI、Eco RI、HindIII限制性酶切图谱；

图3为pRC11和pJP4物理图谱比较；

图4阳性转化子E.coli DH5(dcm⁺)对不同卤代烷烃的降解特性。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：质粒pRC11的获得及鉴定

1)质粒检测：

(1)3mL LB菌液培养过夜，7000转/分4℃离心10分钟；

(2)重悬于l mLTE缓冲液中(40mM Tris-乙酸，2mM EDTA，用冰乙酸调整pH值为7.9)；

(3)加入2mL裂解液(3％SDS，50mM Tris，加1.6mL2N NaOH调整pH为12.6)裂解，轻摇混匀：

(4)在50～65℃的水浴中加热20分钟，然后加入2倍体积的氯仿；

(5)轻轻振荡乳化，离心破乳(6000转/分，15分钟，40℃)；

(6)上清液直接进行电泳分析。

用琼脂糖凝胶电泳分析质粒带，条件如下：

琼脂糖浓度0.7％，电泳电压80V，电泳缓冲液TBE，marker为λDNA/HindIII，采用凝胶成像仪分析电泳结果(结果见图1)。

2)质粒的提取：采用碱法提取质粒。

(1)取过夜培养的菌液1.5mL于微量离心管中，用微量离心以最大转速Vmax离心3～4s，弃上清，用吸水纸吸干。

(2)菌体中加入碱裂解液I 100μL，剧烈振荡充分悬浮菌体。

(3)加入200μL新鲜配置的碱裂解液II，快速柔和颠倒数次，以混合内容物。

(4)加入经冰预冷的碱裂解液III 150μL，置于冰上5min。

(5)Vmax离心5min，取上清，转移至另一新的离心管中，重复该步骤一次。

(6)加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)，剧烈振荡。