[发明专利]结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒，主要包括样品DNA提取试剂、PCR反应试剂和特异性扩增引物，其特征在于：所述特异性扩增引物由16S rRNA扩增引物MTC与Rv0355扩增引物CD192组成，所述引物序列如下：

引物MTC：

上游引物MTC-1：5’-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3’

下游引物MTC-2：5’-TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3’

引物CD192：

上游引物CD192-1：5’-TCCGCTGCCGAGAATGTTGTAAT-3’

下游引物CD192-2：5’-CGCGGGCGTGCTGGTATC-3’。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括结核分枝杆菌阳性对照品和非结核分枝杆菌阳性对照品。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由5个冻存管组成：

冻存管A装有裂解液5mL；

冻存管B装有PCR反应体系溶液，组成如下：

溶剂为水；

冻存管C装有0.2mL结核分枝杆菌阳性对照溶液；

冻存管D装有0.2mL非结核分枝杆菌阳性对照溶液；

冻存管E装有稀释液5mL。

4.利用权利要求1所述试剂盒检测结核与非结核分枝杆菌的方法，所述方法包括：

(1)利用DNA提取试剂提取待测样品DNA；

(2)以待测样品DNA为模板，加入PCR反应试剂和特异性扩增引物配制PCR反应体系，进行PCR扩增；

(3)扩增产物进行凝胶成像系统分析，若待测样品扩增出543bp和238bp两条条带，判断为结核分枝杆菌；若待测样品只扩增出543bp条带，则判断为非结核分枝杆菌。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述试剂盒由5个冻存管组成：

冻存管A装有裂解液5mL；

冻存管B装有PCR反应体系溶液，组成如下：

溶剂为水；

冻存管C装有0.2mL结核分枝杆菌阳性对照溶液；

冻存管D装有0.2mL非结核分枝杆菌阳性对照溶液；

冻存管E装有稀释液5mL；

所述方法如下：

(A)富集经4％NaOH消化的样本或菌株，加入冻存管E中稀释液20μL，涡旋震荡混匀后，加入冻存管A中的裂解液20μL；

(B)98℃恒温金属浴30min，13000rpm离心3min后，-20℃保存备用；

(C)分别取冻存管B中的溶液22μL加入PCR反应管中，再分别取冻存管C或D中的阳性对照溶液或待检样品3μL加至各PCR反应管与冻存管B溶液混合；

(D)将各PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增：95℃5min；94℃35s，67℃30s，72℃1min30s，45或者25个循环；72℃10min；

(E)将扩增后的产物在1.5％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析；

(F)结果判定：若待检样品与阳性对照溶液C同时扩增出543bp和238bp两条条带，判断为结核分枝杆菌；若待检样品与阳性对照溶液D同时只扩增出543bp条带，判断为非结核分枝杆菌；若阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带，则判断为阴性；两者均无条带或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带的需重新检测并判定。