[发明专利]一种从疾病动物模型外周血中快速提取循环的非血缘性有核细胞的组合物和试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明主要涉及一种从疾病动物模型外周血中快速提取循环的非血缘性有核细胞的组合物及试剂盒，以及该组合物或试剂盒在用于新药研发、寻找新的生物标示物如肿瘤标示物等基于疾病动物模型的生物医学实验、手动或借助于自动化检测仪器设备的操作中的应用。 

背景技术

提取并检测外周血中的循环的非血缘性有核细胞(如血管内皮细胞，肿瘤上皮细胞)的巨大临床意义早已被人们所证实。目前常用的提取循环的非血缘性有核细胞的方法是利用抗体与这些细胞表面的特殊标识物相结合从而达到直接捕获的目的。然而这种直接捕获的技术手段敏感性低，重复性差，且因表面标识物对于不同种类的细胞表达量差异极大，从而不能作为一种提取血液样品中的非血缘性有核细胞的通用手段。 

近来大量的科研与临床实验已证明通过去除血中的血缘性有核细胞(如白细胞等)从而达到富集提取血中的非血缘性有核细胞是最为有效的手段。虽然此手段过程中涉及的某些单一方法已经有所报道，如免疫磁性颗粒法去除白细胞，血型糖蛋白-A(glycophorinA)交联法去除红细胞，以及必须借助特殊细胞分离器械的免疫磁性颗粒与密度离心结合的初步尝试等，但这些方法耗时长，白细胞 去除率低，靶细胞回收率差，且须使用特殊器材从而带来应用的不便。 

由于上述原因，本发明将基于利用一种密度分离剂(即细胞分离介质)的组合物或试剂盒的离心方法与偶联了抗动物白细胞抗体的免疫磁微粒相结合，在无融破裂解红细胞实验步骤的情况下取得了令人意料不到的实验结果，证明利用此组合物或试剂盒结合上述方法能够快速、高效、特异性地去除血液样品中的绝大部分血缘性有核细胞、红细胞及血浆蛋白质，从而能够快速富集并提取外周血中循环的非血缘性有核细胞，如循环的肿瘤上皮细胞，循环的血管内皮细胞等。 

发明内容

本发明将基于本发明的密度分离剂(即，细胞分离介质)的离心方法一方面提供了一种独特高效地从外周血中分离循环的非血缘性有核细胞，如循环的肿瘤上皮细胞和循环的血管内皮细胞等的组合物。 

另一方面，本发明还提供了一种独特高效地从外周血中分离循环的非血缘性有核细胞，如循环的肿瘤上皮细胞和循环的血管内皮细胞等的试剂盒。 

又一方面，本发明还提供了上述组合物或试剂盒在用于新药研发，寻找新的生物标示物如肿瘤标示物等基于疾病动物模型的生物医学实验、手动或借助于自动化检测仪器设备的操作中的应用。 

一方面，本发明提供了一种用于从疾病动物模型的哺乳类动物血液中快速获取循环的非血缘性有核稀有细胞的组合物，由下述成份组成：缓冲液，包被了抗血缘性有核细胞表面标识物抗体的磁性 或非磁性免疫微球或免疫颗粒，以及细胞分离介质，其中，所述缓冲液的渗透压介于260～320mOsm/kg H₂O、pH为6.8～7.8，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.072～1.076克/毫升，所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅，多聚糖和泛影酸钠或其衍生物，一种含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物。 

优选地，所述免疫微球的比重高于所述细胞分离介质的比重，所述免疫微球或免疫颗粒共价或非共价结合有特异性地识别下述的白细胞表面标示物的一种或多种的多克隆或单克隆抗体：CD3、CD31、CD34、CD45、CD69、CD84、或CD102。 

优选地，所述循环的非血缘性有核稀有细胞选自：循环的具有上皮来源的任何实体瘤细胞、或不具有上皮来源的任何肿瘤细胞，循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，干细胞，以及免疫细胞。 

优选地，其中，所述缓冲液的渗透压介于260～320mOsm/kgH₂O、pH为6.85～7.75，所述含糖溶液为选自以下的糖的溶液：右旋糖苷、多聚糖和泛影酸钠或其衍生物、或蔗糖等，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.0722～1.0758克/毫升。 

疾病动物模型为肿瘤动物模型，所述肿瘤细胞来自动物自身生长，或因引入人或动物的所有上皮来源的实体瘤细胞，包括但不局限于胰腺癌、肺癌、宫颈癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮来源的肿瘤细胞，如黑色素瘤；循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，血中胎儿细胞，干细胞，以及免疫细胞等。 

优选地，所述肿瘤细胞选自所有上皮来源的实体瘤细胞，如肺癌、宫颈癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具 有上皮来源的肿瘤细胞，如黑色素瘤等；循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，血中胎儿细胞，干细胞，以及免疫细胞等。