[发明专利]一种水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原粒子的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原粒子的制备方法。

背景技术

水貂病毒性肠炎，是由水貂肠炎细小病毒(Mink Enteritis Virus，MEV)引起的以剧烈腹泻为主要临床特征的急性、烈性和高度接触性传染病，具有较高的发病率和死亡率。在自然条件下，不同品种和不同年龄的水貂均有感染性，幼貂的感染性极强，病貂的年龄愈小，死亡率愈高。幼貂发病率为50％-60％，致死率高达90％，成年貂多呈慢性经过或隐性感染，发病率为13.8％-85.4％，死亡率高达80％。由MEV引起的水貂病毒性肠炎存在于世界各养貂国家，本病最早于1949年由Schofield报道于加拿大(Schofield F W，Vims enteritis in mink.Am Vet，30：651-654，1949)，1952年由Wills分离鉴定了病原，并命名为水貂肠炎病毒。随着毛皮动物饲养业的发展，病毒性肠炎己经成为危害水貂饲养业的三大疫病之一，给养貂业带来巨大的经济损失(高云等，水貂病毒性肠炎(MEV)流行病学调查及防治，特产科学实验，(4)33-34.1984)。

MEV病毒呈20面立体对称结构，直径20nm～24nm，无囊膜，其基因组为单股线性DNA分子，基因组长约5064nt，是动物DNA病毒中最小的。水貂肠炎细小病毒VP2蛋白是该病毒的主要结构蛋白，病毒的主要抗原位点均在VP2蛋白上，VP2几个碱基和氨基酸的改变就会影响病毒的生物学特征(Steinel A，et a1，Genetic characterizatinn of feline parvovirus sequences from various carnivores，J Gen ViroL，81(2)：345-350，2000)。MEV不能在鸡胚组织中增殖，能在猫肾细胞系等多种猫源细胞培养物及水貂肾、脾、心肌细胞株培养中增殖，产生细胞病变(吴志明等，动物疫病防控知识宝典，北京：中国农业出版社，358-360，2006)。MEV的血凝性较弱，仅在4℃，pH6.0～7.2条件下对猪和恒河猴的红细胞有凝集作用，也能凝集马和猫的红细胞，但Rivera等分离的MEV-S株对猪、猴或马、牛、恒河猴的红细胞均不表现凝集作用(廖国安，水貂病毒性肠炎，中国预防兽医学报，12(2)：53-55，1990)。

患此病的水貂主要的症状是腹泻，临床上分为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型。最急性病貂只表现拒食，不见肠炎症状，于12-24h死亡。根据病变特点可作出初步诊断，结合实验室检测病死水貂组织中的病毒抗原进行确诊，主要用血凝实验(HA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫电镜技术及分子生物学方法。

目前，MEV基因工程疫苗研究仍然存在一些问题：大肠杆菌表达的MEV-VP2蛋白具有不可溶性及免疫效果相对较差的缺点，其应用前景并不乐观；重组病毒疫苗存在向环境扩散经遗传修饰的生物体安全问题；采用转基因植物生产MEV-VP2蛋白的表达水平目前还不理想；因而研制MEV安全、高效的新型疫苗势在必行。

近年来，应用病毒样颗粒(VLPs)作为疫苗的抗原载体越来越受到广大科学家的重视。VLPs常可以诱导产生较灭活疫苗和可溶性多肽更为强烈的体液免疫应答，因为其表面是以非感染性的颗粒状态模拟天然抗原呈递过程来呈递糖蛋白抗原的，而该法提呈引起的免疫应答优于溶解状态，故在保护作用中起重要作用的糖蛋白抗原引起的免疫应答可望更接近自然感染，这样，病毒样颗粒更有可能广泛用于疫苗的研制。而且，VLPs由于不包裹核酸，不能复制，因此也没有感染性，是一种安全的抗原载体(Nagesha H S，Virus-like particles of calicivirus as epitope carriers，Arch Virol，144：2429-2439，1999)。