[发明专利]呕吐毒素杂交瘤、单克隆抗体及其制备方法与用途无效
申请号: | 201110254503.8 | 申请日: | 2011-08-31 |
公开(公告)号: | CN102952782A | 公开(公告)日: | 2013-03-06 |
发明(设计)人: | 何方洋;韩黎;吴鹏;冯才伟;罗贵昆;韩雪琳;孙震;赵正苗;李勇;陈勇;冯才茂;罗晓琴 | 申请(专利权)人: | 北京勤邦生物技术有限公司 |
主分类号: | C12N5/20 | 分类号: | C12N5/20;C07K16/14;G01N33/577;C12R1/91 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 呕吐 毒素 杂交瘤 单克隆抗体 及其 制备 方法 用途 | ||
技术领域
本发明涉及一种杂交瘤、单克隆抗体及其制备与用途,具体涉及呕吐毒素杂交瘤、呕吐毒素单克隆抗体及其制备方法与用途。
技术背景
呕吐毒素(化学结构式见图1),化学上称作脱氧腐镰刀菌烯醇,属于霉菌的单端孢菌素族,具有很高的细胞毒性及免疫抑制性质,禾谷镰刀菌、拟枝镰刀菌,梨孢镰刀菌等镰刀菌株及头孢均属、漆班菌属、木霉菌等菌株都可产生该毒素,呕吐毒素对粮谷类的污染非常普遍。呕吐毒素可引起雏鸭、猪、猫、狗等动物严重的呕吐反应,严重者可造成死亡。急性中毒的动物主要表现为站立不稳、反应迟钝、竖毛、食欲下降、呕吐等,还可引起动物的拒食反应,其中猪对呕吐毒素最为敏感,呕吐毒素能引起猪食欲减退或废绝、呕吐、体重下降,流产、死胎和弱仔,抑制免疫机能和降低机体抵抗力。
目前,呕吐毒素的检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法等,仪器设备昂贵,技术水平要求较高,样品还需要进行纯化处理,不利于现场筛查。薄层色谱,样品前处理繁琐,实验过程复杂,所需时间长,准确性差,对实验人员危害较大,亦不利于现场筛查。
酶联免疫分析技术,现在已经广泛应用于快速、微量检测药物残留,酶联免疫分析技术可定性定量检测微量残留有害物质,且对仪器要求低,成本低,操作快速简便,对样本前处理过程简单,对检测人员专业要求低,灵敏度较高,可适用于现场大量样本快速检测,实现酶联免疫检测技术的关键是合成抗体。
发明内容
本发明提供针对现有技术的上述不足,提供了一种呕吐毒素杂交瘤、单克隆抗体及其制备方法与用途。
一种呕吐毒素杂交瘤细胞株D-2-1CGMCC No.5161。
一种呕吐毒素单克隆抗体是由杂交瘤细胞D-2-1CGMCC No.5161分泌的。
一种呕吐毒素单克隆抗体的制备方法,其特征在于以呕吐毒素半抗原与牛血清白蛋白偶联物为免疫抗原,免疫Balb/C小鼠,将小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0制备杂交瘤细胞,经间接ELISA筛选和有限稀释法获得单克隆抗体杂交瘤细胞株,将杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。
免疫抗原是由呕吐毒素与马来酸酐缩合反应,再与牛血清白蛋白偶联得到的。
本发明的提供一种基于上述方法制备的抗原及其单克隆抗体用于检测呕吐毒素及其含量的ELISA测定方法。
本发明所述的一种检测呕吐毒素及其含量的ELISA测定方法,样本中的呕吐毒素可以与包被抗原对抗体发生竞争反应,根据其吸光度的数值可以从标准曲线上推算出样品中呕吐毒素的含量,该方法的灵敏度可达到0.5μg/L。
有益效果:本发明提供的单克隆抗体可特异性检测呕吐毒素,灵敏度较高,本发明单克隆抗体制备的ELISA试剂盒可以对食品中呕吐毒素进行快速检测,具有特异性高,灵敏度高,无需大型仪器设备,操作简便,便于推广应用的优点。
附图说明:
图1呕吐毒素结构式。
图2呕吐毒素半抗原合成路线图。
图3呕吐毒素标准品竞争ELISA曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1 呕吐毒素完全抗原合成
(1)呕吐毒素半抗原合成(合成技术路线见图2)
20-100mg呕吐毒素(购自上海安普科学仪器有限公司,货号CDFV-ALX-630-115-M001),与1-3mol马来酸酐,催化量的DMAP,在2-5ml甲苯中,于室温80℃搅拌反应,8-20h后,蒸干溶剂,酸化,萃取,重结晶后得 到呕吐毒素半抗原。
(2)呕吐毒素免疫抗原合成
将呕吐毒素半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免疫原。
取60mg牛血清白蛋白溶于9.5ml PBS(0.01mol/L,pH5.0)溶液中,加入12.5mg EDC,加入1mlDMF溶解的10mg呕吐毒素半抗原,室温搅拌1h,再加6mg EDC,暗处搅拌反应并过夜,用0.01mol/LPBS透析3天,每天换3次透析液,得到呕吐毒素与牛血清白蛋白的免疫抗原。
(3)呕吐毒素包被抗原合成
将呕吐毒素半抗原与卵清蛋白偶联得到免疫原。
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