[发明专利]一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

2010年以来，我国部分地区饲养的蛋鸭和种鸭，发生了一种新型流行性疾病，该疾病以突发性产蛋下降为主要特点，主要导致卵泡变形、变性，卵泡膜充血、出血，输卵管炎性病变，暂将该流行性疾病称为鸭出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis，DHO)。我们在某大型鸭场的发病种鸭上分离到一株病毒，经初步鉴定该病毒为有囊膜的RNA病毒，RT-PCR鉴定黄病毒阳性，暂将该病毒称为鸭黄病毒(Duck Flavivirus)。

由于对该新型流行疾病无特效治疗方法，疫苗的研制开发是控制该疾病的首选措施。

发明内容

本发明的目的在于利用本发明人自行分离、鉴定、保存的一株鸭黄病毒WFG36株作为疫苗生产用病毒株，通过使用6～14日龄的鸡胚或6～14日龄的鸭胚或Vero细胞或CEF细胞或BHK细胞或PK15细胞进行病毒的繁殖及抗原的制备，再经过灭活、配苗等步骤，制备出一种安全、有效的新型鸭病疫苗——鸭出血性卵巢炎灭活疫苗。

1.疫苗生产用病毒株

(1)病毒来源

疫苗制造及检验用毒种为鸭黄病毒(Duck Flavivirus)WFG36株，由本发明人从山东地区某养殖场的种鸭体内分离得到，并进行鉴定、保管和供应。该病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.4718。

(2)病毒株特性

1)病毒含量

将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4 3个稀释度分别经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚5枚，0.1ml/胚，置37℃继续孵育，24小时之内死亡胚弃去不计，24小时之后死亡鸡胚随时取出，置于4℃保存，观察至168小时，根据鸡胚死亡数计算ELD₅₀，每0.1ml病毒含量应≥10^3.0ELD₅₀。

2)对鸡胚的毒力

将毒种用灭菌生理盐水作100倍稀释，卵黄囊接种7日龄易感鸡胚10枚，0.1ml/胚，置37℃继续孵育，鸡胚应于接种后24～168小时死亡8枚以上，死亡胎儿出现全身性出血。

3)免疫原性

将毒种经卵黄囊接种7日龄易感鸡胚，收获感染胚液和胚体，胚体加生理盐水研磨后，与胚液混合，经甲醛溶液灭活后，按1∶2(水相∶油相)的比例制成油乳剂灭活疫苗。

取10只7～10日龄健康易感雏鸭，平均分为两组，5只作为试验组，5只作为空白对照组，试验组每只颈背皮下注射疫苗0.5ml，接种后21天，用鸭黄病毒WFG36株作为攻毒毒株进行攻毒，点眼、滴鼻0.2ml/只，肌注0.3ml/只。攻毒后第7天，采集每只鸭的抗凝血，分离血浆，分别经卵黄囊接种7日龄易感鸡胚5枚，0.2ml/胚，接种后观察7天，免疫组应至少4只病毒分离阴性，对照组应至少4只病毒分离阳性。

4)纯净

按现行《中国兽药典》附录进行，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

5)特异性

将毒种用灭菌生理盐水稀释100倍，与等量抗鸭黄病毒特异性血清混合后，37℃中和1小时，卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚10枚，0.2ml/胚，观察168小时，应不引起特异性死亡或感染，非特异性死亡鸡胚应不超过1枚。

2.一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的制备方法，主要是：使用鸭黄病毒WFG36株作为疫苗生产用种毒，使用6～14日龄的鸡胚或6～14日龄的鸭胚或Vero细胞或CEF细胞或BHK细胞或PK15细胞进行病毒的繁殖及抗原的制备，每0.1ml抗原病毒含量应≥10^3.0ELD₅₀；抗原经甲醛溶液或β-丙内酯或二乙烯亚胺灭活后按常规方法制取水相，与矿物油制成的油相混合而成灭活油佐剂疫苗。

具体有以下制备步骤：

(1)选择鸭黄病毒WFG36株作为疫苗生产用种毒；

(2)选择6～14日龄的对鸭黄病毒易感的鸡胚或6～14日龄的对鸭黄病毒易感的鸭胚或Vero细胞或CEF细胞或BHK细胞或PK15细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料；

(3)抗原的制备可通过以下6种途径实现：

1)用6～14日龄的易感鸡胚作为病毒繁殖及抗原制备用材料