[发明专利]转葡糖苷酶及其制备和固定化方法

说明书

技术领域

本发明属于酶工程和发酵工程领域，涉及一种转葡糖苷酶及其制备和固定化方法。具体是以从土壤中筛选的黑曲霉菌株（Aspergillus niger）BLB-16为出发菌株，经诱变、筛选得到优化菌株BLB-28，并经发酵、除菌、浓缩制备转葡糖苷酶液，还涉及该转葡糖苷酶的固定化技术。

背景技术

转葡糖苷酶（Transglucosidase），也称为葡萄糖转苷酶、α-葡萄糖苷酶、α-转移葡萄糖苷酶、α-D-葡萄糖转苷酶等，依据《酶的命名和国际分类编号》，属于转移酶类，具体为EC 2.4.1.24，CAS为 9030-12-0。 

按照《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760）的分类标准，转葡糖苷酶是一种酶制剂，属于食品工业用加工助剂。

转葡萄苷酶主要作用是从底物的非还原端切开α-1,4糖苷键，释放出α-D-葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基以α-1,6糖苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到低聚异麦芽糖。

低聚异麦芽糖是由2-10个单糖分子通过α-1,6糖苷键构成的功能性低聚糖，主要成分为异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖及四糖以上的低聚糖。天然存在于蜂蜜等众多食品中，由于人体消化道内没有分解低聚异麦芽糖的酶，因此，它在摄入人体后，具有不被人体消化吸收、促进肠道有益菌群增殖、润肠通便、调节血脂、低甜度、低热量等独特功效，尤其是在促进肠道有益菌群的增值方面功效显著。已被广泛应用于乳制品、可可制品、糖果类、焙烤食品、冷冻饮品、饮料、酒类、肉制品、果冻、油炸食品、膨化食品、婴幼儿食品等。目前，国内年消费量在数十万吨。

但是，转葡糖苷酶作为低聚异麦芽糖生产中最关键的酶制剂，在国内却一直没有实现工业化生产。目前，该酶制剂完全依赖进口，这不仅使得在低聚异麦芽糖的生产中，关键技术被国外相关企业控制，更使得低聚异麦芽糖生产中，酶制剂使用成本高居不下。

现在，在国内，转葡糖苷酶已经引起很多科技工作者的关注，但是，一方面筛选的野生菌株其转葡糖苷酶的表达量非常低，难以实现工业化生产；另一方面，采用基因工程技术构建的大肠杆菌代谢生产一般是胞内酶，其提取工艺复杂，酶活回收率低，也不利用工业化生产。因此，有必要开发研制一种胞外转葡糖苷酶，以适应低聚异麦芽糖生产的需要。

本发明筛选获得了一株可以发酵代谢生产胞外转葡糖苷酶的黑曲霉，并通过诱变优化筛选获得了黑曲霉BLB-28，提高了其转葡糖苷酶的表达量，并采用先进的除菌、纯化、浓缩技术，制备该酶制剂，并通过开发转葡糖苷酶的固定化技术，实现该酶制剂的高效循环利用，不仅实现了该酶制剂的国产化，大大改善国内转葡糖苷酶受制于国际市场的局面，而且能够大幅降低低聚异麦芽糖生产中酶的使用成本。

同时，本发明在进行酶制剂固定化技术的开发中，采用了树脂吸附-海藻酸钠包埋-戊二醛交联法固定化技术，突破了转葡糖苷酶固定化中的技术局限，即一是突破了仅采用树脂加戊二醛交联固定化技术中，由于固定化不够牢固，而使得固定化酶易于脱落、泄露，增加了后续工艺精制、纯化低聚异麦芽糖的难度等难题；二是突破了仅采用海藻酸钠包埋加 CaCl₂硬化固定化技术中，由于硬度较低，难以在大型填充柱中使用，而直接添加至糖液中，则需过滤，增加了工艺的复杂性等难题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种黑曲霉菌株（Aspergillus niger）BLB-28，它是以从土壤中筛选的黑曲霉（Aspergillus niger）BLB-16为出发菌株 ，经紫外线+LiCl复合诱变，并经筛选获得；该菌株已于2011年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所内，保藏号CGMCC No 5143。

本发明的另一个目的在于提供一种转葡糖苷酶，它是应用黑曲霉菌株（Aspergillus niger）BLB-28发酵制得。该酶制剂为低聚异麦芽糖生产中的关键酶制剂。其主要作用是在以淀粉为原料的生产过程中，在淀粉经液化和糖化后，进行转苷，即将底物的非还原端切开α-1,4糖苷键，释放出α-D-葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基以α-1,6糖苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到低聚异麦芽糖；采用本发明中的转葡糖苷酶生产低聚糖，与采用进口酶制剂相比，酶制剂使用成本降低300-400元。