[发明专利]一种筛选猪抗病育种的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种筛选猪抗病育种的方法，通过判断猪Mx1基因5′调控区的突变位点的多态性来进行选种，并人为的应用该突变位点实现优良育种。

背景技术

黏病毒抗性蛋白A (Myxovirus resistance protein 1， Mx1)是干扰素(IFN)诱导蛋白之一，该蛋白具有抗多种病毒的活性。Mx1是由Ⅰ型干扰素(IFNα/β)诱导细胞所产生的78000 u的抗病毒蛋白，是继发现由IFN诱导细胞产生2.5 A寡腺苷酸合酶和蛋白酶之后发现的新型抗病毒蛋白。哺乳动物中，Mx家族中具有抗病毒作用的称为MxA或Mx1，分布于细胞的胞浆内，这种胞浆蛋白可直接发挥对流感病毒和滤泡性口腔炎病毒(VSV)的抗病毒效应，而Mx2或MxB未发现有抗病毒活性。研究证明，Mx1蛋白在体内外均能独立发挥抗病毒活性，并且无需IFN的诱导和协同。体外实验表明，哺乳动物单核细胞在受到人类免疫缺陷病毒(HIV)感染后Mx1表达不依赖于IFN的存在。Mx1蛋白属于大分子GTP酶发动蛋白超家族。Mx1蛋白在氨基末端是 GTPase功能区域，中段是中心活性区域(CID)，羧基末端的亮氨酸拉链序列(LZ)是效应区，LZ与GTP酶效应区的活化和功能协调有关。氨基酸末端区域包含的三联 GTP结合区域高度保守，但羧基端区域的变异多。亮氨酸拉链区(LZ)近端第612位的突变 (由亮氨酸→赖氨酸)，使得Mx1(L612K)突变体丧失了自聚集和水解 GTP的能力，证明寡聚体是GTP酶活性的重要调节因子。通过突变发现，三联GTP结合区域是Mx1发挥抗病毒作用所必须的结构。对人Mx1蛋白进一步研究发现位于羧基末端附近的氨基酸决定了其抗病毒的特异性，当Mx1 蛋白的第 645位的氨基酸由谷氨酸变为精氨酸时，表达Mx1蛋白的小鼠 3T3细胞失去了对 VSV的抵抗力，但却继续保持了对流感病毒和Thogoto病毒的抵抗力。Mx1基因的表达与 IFN mRNA水平相一致。IFN处理可剂量依赖性地抑制流感病毒在 PBMCs中的复制，IFNγ没有此效果，同时这种抑制效果与Mx1蛋白的水平增高相关。在持续表达Mx1的转基因细胞中，流感病毒的复制也受到抑制。结果显示 Mx1蛋白在 IFN介导的宿主防御流感病毒A机制中起到重要作用。Mx1基因在抗病毒防御中的重要作用已经在小鼠模型中得以充分研究。敲除 Mx1基因可导致小鼠对流感病毒的天然免疫完全丧失，引起过度感染和快速死亡。诱导Mx1表达足以使该易感小鼠获得抵抗力。更重要的是，在对IFN无反应的动物中，持续表达Mx1可具有完全的抗病毒能力。通过分子标记确定Mx1高表达对于提高动物抗病性具有重要的育种意义。

发明内容

基于上述的原因，本发明为了筛选出猪抗病相关的基因标记，建立猪分子标记辅助育种方法，为猪抗病品种培育提供基因标记和技术方法。根据现有技术，发明人通过进一步的实验发现猪Mx1  5′调控区-567位点的275bp插入突变与其连锁的其它位点的突变在体外试验中改变了Mx1启动子的活性，两者差异极显著，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

本发明提供的一种筛选猪抗病育种的方法，该方法通过测定从该动物获得的DNA样品中Mx1基因的多态性来实现；通过多态性的测定结果，选出具有与所需特征相关的猪进行育种；

所述的多态性是与抗病毒蛋白相关的多态性。

其具体方法如下：

（1）猪基因组DNA的获得；

（2）以上述猪基因组DNA为模板，扩增Mx1基因5′调控区序列；

（3）鉴定Mx1基因5′调控区-567处的多态性；

其中步骤（3）中所述Mx1基因的5′调控区-567处的多态性是指此处有无一个275bp的插入，其基因序列如SEQ ID NO:5所示的插入突变。

具体的标记方法为：

采用标记引物Mx1 P，包括