[发明专利]培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的生产方法，尤其是一种培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的方法。

背景技术

四氢嘧啶是一种嗜盐微生物为了抵御外界高盐浓度的体内合成的一种相容性溶质，并且一些嗜盐微生物能够合成四氢嘧啶的衍生物-羟基四氢嘧啶。四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶与其他已知的相容性溶质相比，其对细胞、核酸、酶、蛋白等在射线、干燥、冷冻、高温、高盐等极端条件下具有更好的保护作用。

由于其特殊的结构，截至目前还不能够人工合成四氢嘧啶或者羟基四氢嘧啶，只能通过微生物胞内合成获得。目前据公开文献报道，四氢嘧啶的合成主要是采用细菌挤奶法进行生产，以及进行高密度发酵。

普通发酵方法是：对于四氢嘧啶的生产，种子培养同上述1，2步骤，然后150ml种子菌液接种到3L发酵培养基，30℃培养，pH控制在7.0-7.2，。发酵培养基中氯化钠浓度为3M，其它同上。培养42h离心收集菌体，酒精提取四氢嘧啶，浓缩，膜过滤，结晶得到产物。对于羟基四氢嘧啶的生产，种子培养同上述1，2步骤，然后150ml种子菌液接种到3L发酵培养基，30℃培养20h后42℃培养，pH控制在7.0-7.2。发酵培养基中氯化钠浓度控制在3M，继续培养31h后离心收集菌体，酒精提取四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶，浓缩，膜过滤，结晶得到产物。

由于嗜盐菌的最适生长的盐浓度和能够达到高产四氢嘧啶的盐浓度不一致，影响了四氢嘧啶的合成效率，例如中度嗜盐菌Halomonas ventosae DL7，其最适生长盐浓度为1M，但是最优合成四氢嘧啶的盐浓度为3M。羟基四氢嘧啶作为四氢嘧啶的衍生物其合成受到热刺激的诱导，在嗜盐菌的最优生长温度下只有少量合成，通常要提高生长温度才能够较多量的合成，例如Halomonas ventosae DL7在营养培养基试管中摇床培养，培养温度从30℃提高到37℃或者42℃，但是提高生长温度严重抑制了其生长，又导致了四氢嘧啶合成量的严重下降，也从而影响了羟基四氢嘧啶的产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种以合理成本提高四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的合成效率的培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的方法。

实现本发明目的之一的培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶的方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化，将嗜盐菌种放入盛有营养液的试管中，在摇床上进行培养活化；

(2)种子培养，将活化后的菌种放入盛有培养液和嗜盐菌种的三角瓶中，在摇床上进行培养；

(3)发酵阶段，发酵在嗜盐菌的最优生长盐分下培养，将细胞增殖到最高浓度；

(4)通过补料将培养基的盐浓度迅速提高到3～3.5M，然后继续培养3～8h，使四氢嘧啶的合成量大大提高。

所述步骤(1)中的菌种活化是在温度30℃，摇床培养18～24h。

所述步骤(2)中的种子培养是在温度30℃，摇床培养18～24h。

所述步骤(3)中的最优生长盐分是1～2M NaCl，培养18～24h，达到最高浓度。

所述步骤(4)中的补料提高盐浓度的时间为1～2h。

实现本发明目的之二的培养嗜盐微生物生产羟基四氢嘧啶的方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化，将嗜盐菌种放入盛有营养液的试管中，在摇床上进行培养活化；

(2)种子培养，将活化后的菌种放入盛有培养液和嗜盐菌种的三角瓶中，在摇床上进行培养；

(3)发酵阶段，发酵在嗜盐菌的最优生长盐分下培养，将细胞增殖到最高浓度；

(4)通过补料将培养基的盐浓度迅速提高到3～3.5M，然后继续培养3-8h，使四氢嘧啶的合成量大大提高；

(5)将培养温度从最优生长温度提高到较高温度，继续培养3～10h，获得较高的羟基四氢嘧啶合成量。

所述步骤(1)中的菌种活化是在温度30℃，摇床培养18～24h；所述步骤(2)中的种子培养是在温度30℃，摇床培养18～24h。

所述步骤(3)中的最优生长盐分是1～2M NaCl，培养18～24h，达到最高浓度。

所述步骤(4)中的补料提高盐浓度的时间为1～2h。

所述步骤(5)中的最优生长温度是30～32℃；提高温度的时间是1～2h；所述较高温度是37～42℃。

本发明的培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的方法的有益效果如下：