[发明专利]胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种胃蛋白酶原PGII的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含PGII磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，PGII校准品、PGII质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的PGII磁分离试剂含有标记有抗PGI I单克隆抗体的磁性微球；

所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗PGII单克隆抗体；

所述的反应增强剂是含有Tris的缓冲液；

所述稀释液是含有BSA的溶液；

所述的校准品及质控品是含有一定量的PGII抗原的BSA溶液；

所述清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液；

所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。

3.如权利要求1-2任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得：

一、磁分离试剂的制备过程

一)、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制1L：

1、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；

3、调节PH，控制PH在7.95-8.05之间；

4、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；

5、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得；

二)、磁分离试剂的制备过程

1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗PGII单克隆抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；

2、用移液枪吸取上述辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；

3、将步骤2的溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下离心30min浓缩至0.5ml；

4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，经磁铁吸附2分钟后吸取上清，然后加入1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀30秒，然后加入步骤3获得的抗体溶液，混匀后室温反应4小时；

5、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟，然后加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒；

6、用100ml磁珠保存液将磁珠转入玻璃瓶；

7、将步骤6获得的溶液与上述磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得权利要求1或2所述试剂盒中的磁分离试剂；

二、酶反应物的制备过程

一)、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制1L：

1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl₂ 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl₂ 0.05g于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；

2、调PH，控制PH在7.35-7.45范围内；

3、称取BSA 3g倒入上述烧杯中；

4、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得；

二)、碱性磷酸酶ALP与抗PGII单克隆抗体的偶联

1、取10mgALP加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1毫升；

2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，收集保留液；

3、向步骤2获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗PGII单克隆抗体，搅拌2小时，再加入0.1ml的4mg/ml NaBH₄溶液，混匀，置4℃下2小时；

4、将上述溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；

5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的PBS中；

6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲液透析5个小时去除铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为1∶100的比例添加1M MgCl₂溶液，即得碱性磷酸酶ALP与抗PGII单克隆抗体的偶联物；将收集到的碱性磷酸酶ALP与抗PGII单克隆抗体的偶联物用上述步骤一)获得的酶反应物稀释液以1∶1000的体积比混合均匀，即得酶反应物。

三、反应增强剂的制备过程，配制1L：

1、取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中，取0.2ml Proclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

2、取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，调PH在7.35-7.45之间；

3、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤即得；

四、稀释液的制备过程，配制1L：

1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中；

2、取0.5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；

3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤即得；

五、PGII校准品和PGII质控品的配制：

PGII校准品中PGII抗原的浓度分别为5、15、30、80、160ng/ml；PGII质控品中PGII抗原的浓度分别为15、80ng/ml；

六、清洗液浓缩液的制备过程，配制1L：

1、取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；

2、取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

3、取0.2ml Proclin-300于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

4、取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；

5、调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；

6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得；

七、底物溶液的制备过程，配制1L：

1、取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na₂SO₃ 0.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中；

2、取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调PH在7.95-8.05之间；

3、加入250ml Lumi-Phos 480，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。