[发明专利]总甲状腺素(TT4)定量测定试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种总甲状腺素TT4的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含TT4磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，TT4校准品、TT4质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的TT4磁分离试剂含有标记有抗TT4单克隆抗体的磁性微球；

所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的TT4抗原；

所述的反应增强剂是含有Tris的缓冲液；

所述稀释液是含有BSA的溶液；

所述的校准品及质控品是含有一定量的TT4抗原的BSA溶液；

所述清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液；

所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。

3.如权利要求1-2任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得：

一、磁分离试剂的制备过程

一)、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制1L：

1、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；

3、调节PH，控制PH在7.95-8.05之间；

4、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；

5、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得；

二)、磁分离试剂的制备过程

1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗TT4单克隆抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；

2、用移液枪吸取上述辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；

3、将步骤2抗体溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下离心30min浓缩至0.5ml；

4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，经磁铁吸附2分钟后吸取上清，然后加入1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀30秒，然后加入步骤3获得的抗体溶液，混匀后室温反应4小时；

5、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟，然后加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒；

6、用100ml磁珠保存液将磁珠转入玻璃瓶；

7、将步骤6获得的溶液与上述磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得权利要求1或2所述试剂盒中的磁分离试剂；

二、酶反应物的制备过程

一)、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制1L：

1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl₂ 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl₂ 0.05g于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；

2、调PH，控制PH在7.35-7.45范围内；

3、称取BSA 3g倒入上述烧杯中；

4、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得；

二)、碱性磷酸酶ALP与TT4抗原的偶联

1、取TT4抗原；

2、取200ul DMSO溶解抗原使抗原的终浓度到达5mg/ml，充分混匀；

3、按照1mol抗原加入5mol的辛二酸二琥珀酰亚胺酯的摩尔比例加辛二酸二琥珀酰亚胺酯到步骤2的溶液中，37℃恒温箱中反应1.5小时；

4、按照5mol抗原加入1mol的ALP的摩尔比往步骤3溶液中添加ALP，然后加入1mlPH为7.4浓度为0.1M的PB缓冲液，置于37度恒温箱中反应3小时；

5、将步骤4的溶液用PD-10柱纯化，收集纯化液，按照1∶5000的体积比添加上述步骤一)获得的酶反应物稀释液，混合均匀，即得酶反应物。

三、反应增强剂的制备过程，配制1L：

1、取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中，取0.2ml Proclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

2、取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，调PH在7.35-7.45之间；

3、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤即得；

四、稀释液的制备过程，配制1L：

1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中；

2、取0.5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；

3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤即得；

五、TT4校准品和TT4质控品的配制：

TT4校准品中TT4抗原的浓度分别为20，40，80，150，300ng/ml；TT4质控品中TT4抗原的浓度分别为40，150ng/ml；

六、清洗液浓缩液的制备过程，配制1L：

1、取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；

2、取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

3、取0.2ml Proclin-300于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

4、取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；

5、调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；

6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得；

七、底物溶液的制备过程，配制1L：

1、取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na₂SO₃ 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L烧杯中；

2、取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调PH在7.95-8.05之间；

3、加入250ml Lumi-Phos 480，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。