[发明专利]一种用于扩增长片段的乳浊液体系制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及一种用于扩增长片段的乳浊液体系的制备方法。

背景技术

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)作为分子生物学里程碑式的技术，已经广泛应用于各个学科。与此同时，由于新的目的与要求，这项传统的技术也在日新月异的发展之中。

在高通量测序技术领域，已经出现乳液PCR(emulsion PCR，ePCR)技术，通过各自独立的油包水液滴反应空间，能够在大规模扩增基因的同时，保持扩增产物的各自分离，而进行ePCR反应的关键在于乳浊液体系的制备。随着高通量测序中对通量的要求越来越高，对测序片段的长度也要求越来越高。目前乳浊液体系的制备出现由于液滴数量较少、体积过小而制约扩增片段的扩增长度的问题，这严重限制高通量测序技术的发展。

针对上述缺陷，急需一种能够用于扩增长片段且含有更多液滴数量的乳浊液体系制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于扩增长片段并且含有更多液滴数量的乳浊液体系制备的技术方法，旨在解决乳浊液体系中扩增长度短、液滴数量少和/或体积小的问题。

为实现本发明的目的，所述用于扩增长片段的乳浊液体系制备方法步骤如下所示：

A.制备包含连有目的扩增片段对应引物的固相载体的水相体系；

B.制备包含多种油脂混合在内的油相体系；

C.将水相与油相体系混合，制备乳浊液体系；

其中，步骤A和步骤B无先后顺序。

其中，步骤A中包括：

A1.将目的扩增片段对应的引物连接到固相载体，得到带引物的固相载体；

A2.将其他扩增体系试剂与带引物的固相载体混合，制备水相体系。

其中，上述固相载体可以选用微珠或者磁球，其表面可以采用聚丙烯酰胺修饰、醛基修饰或链霉亲和素修饰；相应的，结合的引物则采用丙烯酰胺修饰、氨基修饰或生物素修饰。

其中，上述水相体系，包含连有目的扩增片段对应引物的固相载体，包含扩增反应所必需的其他试剂，同时还加入能加快扩增反应启动的一对小引物。

其中，上述步骤B中选择用于制备油相体系的各种油脂在热稳定性以及密度上具有一定的要求，它们按照一定比例混合之后要使得形成的油相体系的热稳定性可以保证制备出来的乳浊液体系在反应过程中不会破裂，而且它们的混合密度要能使之后放入的辅助微固体材料如钢珠等可以在其中自由移动，具体的油相组成将会在实施例中给出。

其中，所述步骤C包括：

C1.将水相加入到油相体系中混合，得到水油混合体系；

C2.水油混合体系中加入辅助微固体，得到乳浊液混合物；

C3.将乳浊液混合物放置于乳浊液制备仪上，振荡打匀形成乳浊液体系。

其中，上述步骤C1中水、油两相的混合顺序可以调整，采取不同的方式。

其中，上述步骤C2中辅助微固体可以采用钢珠、玻璃珠或塑料珠的至少一种。

其中，上述步骤C3中利用乳浊液制备仪制备乳浊液的条件根据待测模板长度和固相载体的大小变化，可以选择不同的振荡频率。

其中，上述步骤C之后还可包括步骤

D.利用制备的乳浊液体系进行ePCR扩增反应。

其中，根据连接在固相表面的引物的不同，可以进行不同的PCR扩增反应：若只固定了一条引物，则可以进行单引物扩增反应；若分别固定了上、下游两端引物，则可以进行双引物扩增反应，由此可以进一步延长扩增片段的长度。

由上可知，本发明通过控制水油两相体系的混合比例以及制备时的振荡频率和时间，对乳浊液的制备进行控制，使其能够得到更多的液滴数量，同时在保证稳定的前提下，增大液滴的体积，使其能够应用于更长片段的扩增反应体系中。

附图说明

图1是本发明一个实施例中用于扩增长片段的乳浊液体系制备方法流程图。

图2是本发明实施例中制备包含连有目的扩增片段对应引物的固相载体的水相体系的方法流程图。

图3是本发明实施例中水油两相混合制备乳浊液体系的方法流程图。

图4是本发明一个实施例中基于制备好的扩增长片段的乳浊液体系进行桥式ePCR扩增反应的方法流程图。

图5是本发明一个实施例中基于制备好的扩增长片段的乳浊液体系进行桥式ePCR扩增反应的示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。