[发明专利]一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法

权利要求书

1.一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂分别按质量比0～1∶2～30∶100和0～1∶1～20∶100混合均匀配制成水凝胶单体浓度不同的两份水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮或艳固佳2959，水凝胶单体为胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸纳或聚乙二醇及其衍生物，水凝胶溶剂为去离子水、纯水或PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液；

第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶单体浓度高的水凝胶溶胶与细胞浓度为10⁷～10¹¹cells/mL细胞培养液按体积比20～100∶1混合均匀形成第一混合液A，将水凝胶单体浓度低的水凝胶溶胶与细胞浓度为10⁷～10¹¹cells/mL细胞培养液按体积比1～20∶1混合均匀形成第二混合液B，细胞培养液中的细胞为酵母菌、乳酸菌、双歧杆菌、放线菌、酪酸梭菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或粪链球菌；

第三步，分别将第一混合液A和第二混合液B装入细胞打印机的两套不同的注射器中，设定好细胞打印机的运行程序；

第四步，在培养皿表面打印一层细胞与水凝胶溶胶的混合液，其中需要微孔的地方打印第一混合液A，需要微通道的地方打印第二混合液B，因第二混合液B水凝胶单体浓度低，细胞浓度高，有助于形成连通的微通道；

第五步，改变温度、离子浓度或紫外照射，使打印的混合液发生交联形成载细胞的水凝胶；

第六步，重复第四步和第五步，直至形成所需三维结构的载细胞水凝胶支架；

第七步，将上述制备的载细胞水凝胶支架置于培养箱中培养0～15天；

第八步，将培养后的载细胞水凝胶支架在质量浓度3％～10％的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡12～24小时使细胞完全裂解死亡后，分别用杜氏磷酸缓冲液和去离子水先后冲洗2～8小时，最终获得带有复杂微通道的三维多孔水凝胶支架。

2.根据权利要求1所述的一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，制备水凝胶溶胶，将水凝胶单体和水凝胶溶剂分别按质量比2∶100和1.5∶100混合均匀配制成水凝胶单体浓度不同的两份水凝胶溶胶，水凝胶单体为胶原，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液；

第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶单体浓度高的水凝胶溶胶与细胞浓度为10¹⁰cells/mL细胞培养液按体积比100∶1混合均匀形成第一混合液A，将水凝胶单体浓度低的水凝胶溶胶与细胞浓度为10¹⁰cells/mL细胞培养液按体积比10∶1混合均匀形成第二混合液B，细胞培养液中的细胞为酵母菌；

第三步，分别将第一混合液A和第二混合液B装入细胞打印机的两套不同的注射器中，设定好细胞打印机的运行程序；

第四步，在培养皿表面打印一层细胞与水凝胶溶胶的混合液，其中需要微孔的地方打印第一混合液A，需要微通道的地方打印第二混合液B，因第二混合液B水凝胶单体浓度低，细胞浓度高，有助于形成连通的微通道；

第五步，改变温度，使打印的混合液发生交联形成载细胞的水凝胶；

第六步，重复第四步和第五步，直至形成所需三维结构的载细胞水凝胶支架；

第七步，将上述制备的载细胞水凝胶支架置于培养箱中培养7天；

第八步，将培养后的载细胞水凝胶支架在质量浓度5％的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡12小时使细胞完全裂解死亡后，分别用杜氏磷酸缓冲液和去离子水先后冲洗2小时，最终获得带有复杂微通道的三维多孔水凝胶支架。