[发明专利]一种碱性条件下具有降解脂肪能力的脂肪酶

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、酶学、生理学领域。具体的说，涉及一种经过分子生物学手段改造、可以耐碱性的脂肪酶DNA序列及其对应的氨基酸序列。

背景技术

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一类催化三酰甘油酯分解、合成和酯交换的酶类，具有极强的选择性和专一性，并具有在水相和有机相界面催化反应的独特性能，已被广泛应用于食品、油脂化工等行业。随着应用领域的拓宽，已涉及到单细胞蛋白生产、化妆品生产、环境保护、新型生物材料、生物传感器、生物医学及生物能源等新兴领域，有着广阔的应用前景。

脂肪酶广泛存在于自然界的动、植物和微生物体内。如：细菌有28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属均能产生脂肪酶。鉴于微生物脂肪酶具有重要的工业应用价值和潜在的巨大需求，许多工业化实验室与科研单位长期从事着繁琐的高产脂肪酶微生物筛选工作，但因为微生物生长条件的复杂性，使得具有特殊性质的脂肪酶资源开发受到微生物生长的限制。

发明内容

本发明的目的是提供了一种新型耐碱性脂肪酶及其结构基因。该基因表达产物脂肪酶在强碱条件下显示活性，应用于含碱性废水中，油脂类物质的处理，在环保领域具有广阔的用途。为了达到本发明的目的，实现本发明的具体技术步骤如下：由GenBank数据库获得变形斑沙雷菌S.proteamaculans脂肪酶基因序列附图1，合成此基因序列并与质粒pUC18相连(不仅限于此克隆载体)，以含脂肪酶基因的质粒DNA作为模板，a(5‘一CTT GAA TTC GAT TAG AGTCGT ATA AGA TG一3，EcoR I)和b(5一CTT GGT ACC TTA ATT CGT ATT CTG TCC TC-3 KpnI)为引物进行易错PCR扩增。每100ul反应体系为：10ul 10x易错PCR缓冲液(500mmol/L KCl，70mmol/L MgCl₂，100mmol/L Tris-HCI pH8.3，0.1％(w/v明胶)；10ul 10XdNTP混合物(2mmol/L dGTP，2mmol/L dATP，10mmol/LdCTP和10mmol/LdTTP)；引物a和b各30pmol；10ul的5mmol/L MnCl2；质粒DNA模板20pmol；Taq DNA聚合酶为5U，再加入灭菌的超纯水至总体积为100ul。PCR程序为：95℃，5min；94℃ 30S，52℃ 1min，72℃1min，35个循环；72℃ 10min。将PCR产物以1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳，用PCR纯化回收试剂盒进行纯化回收。纯化后的易错PCR产物与pMD18-T载体连接(不限于此载体)，转化大肠杆菌DH5a超级感受态细胞(不限于此受体，但受体应于质粒载体对应)，涂布LB(含100ug/mL的Amp)平板，挑选具有插入片段的克隆，组成突变体库。将所有转化子挑取至RB(1000mL LB培养基中加入20mL 0.2％(W/V)罗丹明B和40mL橄榄油乳化液，pH自然)平板，于37℃培养24 h后，选取有变色现象的转化子。分别接种到3mL LB培养基(含100ug/mL氨苄青霉素)，37℃剧烈振摇至OD600约0.6，各吸取3ul菌液滴至罗丹明B平板，37℃C培养12～24h后可见明显变色现象。选取变色快和变色圈大的克隆进行液体发酵，制备足够的菌液量，低温下经IPTG诱导表达后超声波破碎细胞，离心收集上清液，用pNPP法测定脂肪酶活力。分组，调节pH为10，各保持2小时，期间每20分钟测定一次脂肪酶活力见图2，选择一份酶活力降低不足10％的样品，(此后采用相同方法对此转化子的脂肪酶酶液在pH＝9、pH＝8时进行测定，酶活力稳定)，将其对应转化子DNA测序(其核苷酸序列与氨基酸序列见SEQ NO.1和SEQ NO.2)。测序结果表明，结构基因中共有5个碱基发生了突变，分别是a101g、c176g、t335g、g182c、t154g。由此造成的5个氨基酸发生变化(Y34C、P59R、V112A、S61T、L52V)，形成本发明涉及的一种新的碱性条件下具有降解脂肪能力的脂肪酶。

本发明涉及的脂肪酶是一种新型脂肪酶，其一级结构由于5个氨基酸的突变与已知的脂肪酶性质大不相同，从而造成具有更高的耐受碱性的能力，适合于含碱性废水中，油脂类物质的处理，在环保领域具有广阔的用途。

附图说明

图1变形斑沙雷菌S.proteamaculans原脂肪酶基因序列；

图2高pH下脂肪酶活力相对变化；

具体实施方式