[发明专利]快速检测TTX的磁性免疫层析方法及检测试纸条的制备

说明书

技术领域

本发明属于食品检验领域，特别是涉及一种快速检测TTX的磁性免疫层析方法及检测试纸条的制备，属于检测技术类。

背景技术

河豚鱼肉味鲜美，营养丰富，中国、日本等亚洲居民素有食用的习惯，但河豚鱼的卵巢、肝脏、肠道等内脏却富含河豚毒素(Tetrodotoxin，简称TTX)，由于该毒素性质稳定，加之中毒后缺乏有效的解救措施，所以每年均有因误食有毒河豚鱼而中毒的报道，严重威胁消费者的生命安全。

TTX是毒性最强的天然神经毒素之一，在自然界分布非常广泛。除存在于鲀形目鱼种中外，在某些蝾螈、蟾蜍、章鱼、海螺、海星等海水、淡水动物中，以及诸如扁形虫等微生物体内也曾检测出该毒素。TTX理化性质稳定，能溶于水，不溶于无水乙醇和普通有机溶剂。对热、日光、酶类、盐类及酸稳定，易溶于稀醋酸中。TTX的化学结构式如下图所示：

该毒素毒性比氰化钠强1000倍，毒素除直接作用于胃肠道引起局部刺激症状外，并被机体吸收进入血液中，可迅速使神经末梢及神经中枢发生麻痹。首先受害的是感觉神经麻痹，其次为各随机的运动神经末梢麻痹，使机体物理运动不能运动。毒量增大时则导致迷走神经麻痹，呼吸减少，脉搏迟缓，严重时体温及血压下降，最后发生血管运动神经中枢或横隔肌及呼吸神经中枢麻痹，引起呼吸停止，迅速死亡。

TTX的检测技术研究始自20世纪60年代，传统的检测技术主要包括以小鼠检测法(mouse bioassay，MBA)为代表的生物检测技术；以荧光分光光度法(fluorescence spectrophotometry)、液相色谱检测(high pressure liquid chromatography，HPLC)法为代表的仪器检测技术；以及以酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和免疫层析法(lateral flow immunoassay，LFIA)为代表的免疫分析技术等。

(1)TTX的生物检测技术中，小鼠生物法是国际公认的检测方法，而且在日本被定为TTX的官方检测方法并广泛应用。小鼠生物法检测河豚毒素具有直观、快速、症状典型易于判断、易于操作、费用低等优点，且不需要特殊设备，其检测精度能满足水产品安全监测要求等特点，是一种广泛应用于检测河豚毒素的常规方法。该方法基于一定重量的小鼠经腹腔注射毒素后，其死亡时间的倒数与毒素剂量之间存在线性关系，可通过小鼠的死亡时间推断毒素毒力，用小鼠单位(mouse unit，MU)表示。目前1MU的定义是指在30min内杀死一只20g左右的雄性ddy小鼠的毒素量，即1MU相当于0.22μgTTX。但由于其费时费力，重复性差且易受到共存氨基酸和无机离子的影响而导致结果偏低等缺点，在国内并未广泛普及。

(2)TTX的仪器分析检测技术包括了荧光、紫外分光光度分析和色谱分析等。荧光分光光度法是最早建立起来的定量检测TTX的仪器方法，其原理是通过检测荧光化合物C₉碱来测定TTX的量。检出限为0.3mg/ml。TTX在碱性条件下生成C₉碱的同时，也定量生成草酸钠，后者在230nm处有明显的吸收峰，根据此建立的紫外分光光度法检出限为0.02～0.1mg/ml。荧光法和紫外分光光度法操作简便，但灵敏度低，专一性差。

在色谱法中，目前国内多用液相色谱法(HPLC)检测TTX，该方法灵敏度较高(0.2～9.6μg/ml)。我国已制定了相应的国标《GB/T 23217-2008水产品中河豚毒素的测定——液相色谱-荧光检测法》。但该方法的样品前处理比较麻烦，需要进行柱后碱水解然后用荧光检测器测定，且所用仪器昂贵、检测费用相对较高。

此外，日本学者曾采用液相-串联质谱(LC/MS/MS)分析法和液相-飞行时间质谱(LC/TOF-MS)分析法检测TTX，检测限分别达到10ng/m L和0.02μg/g。气相色谱-质谱(GC/MS)联用分析法也曾被用于检测TTX，检测限与LC/MS/MS一致，为10ng/ml。由于色谱分析法检测过程简单、快速，同时配有高灵敏度的检测器，比较灵敏，是常用的检测方法之一，但对样品纯度要求较高。其缺点在于样品处理比较麻烦，所用仪器设备昂贵，检测成本高。