[发明专利]三叶青转基因毛状根的诱导和繁殖方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及三叶青转基因毛状根的诱导和繁殖方法。

(二)背景技术

三叶青，又名金线吊葫芦，学名三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)，为葡萄科崖爬藤属植物，是我国特有的药用植物，具有重要的药用价值，其全草均可入药，晒干或鲜用，以地下块根和果实的药用效果最好。

现代医学研究证实，三叶青的提取物β-谷甾醇三叶青黄酮及多糖能有效抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，是一种极其珍稀的中草药。但三叶青对生长环境要求非常奇特，它须生长在海拔700米的深山密林和悬崖峭壁的背阴面，上面要有散射光，旁边要有细水渗出，下面要有树叶覆盖，常年气温保持在18℃左右才有利于其生长，仅在浙江、广西、江西等山区有少量的自然分布，其中浙江的三叶青为上品；并且，在自然条件下生长速度缓慢。由于三叶青对生长坏境要求苛刻，加上无节制的人为采挖，在自然条件下巳濒临灭绝。虽然，其组织培养快繁和人工栽培技术已取得成功，但从小植株形成带有球形块根的成熟植株周期依然很长，远远满足不了市场需求(伍昭龙，吕江明，中药三叶青的研究现状，中国民族民间医药杂志，2006，(78)：15-18；陈巧利，巩江，曹梦晔，赖智捷，倪士峰，三叶青药学研究新进展，辽宁中医药大学，2011，13(1)：72-74)。

另一方面，毛状根(hairy root)是发根农杆菌所含Ri质粒的T-DNA片段在植物细胞基因组中插入、整合并表达，诱导植物细胞形成的不定根。毛状根在形态上保持了植物原根系统的特征，在生理上具有原根系统完整的代谢通路；毛状根起源于单细胞而不存在嵌合体，在遗传上具有高度的稳定性和一致性。在应用上，由于毛状根具有天然根的结构、能够在不含有植物激素的培养基上快速生长、且遗传稳定性高并能合成和积累次生代谢物质，因此，毛状根可作为生物反应器生产植物的药用活性成分(Hu ZB，Du M.Hairy root and its application in plant genetic engineering.Journal of Integrative Plant Biology，2006，48(2)：121-127)。

根据文献报道，通过发根农杆菌的侵染，在一些药用植物中实现了毛状根的诱导，并从毛状根中分离获得药用活性成分，如：人参、红豆杉、长春花等。而三叶青毛状根的诱导和繁殖一直未攻克。

(三)发明内容

本发明目的是提供三叶青转基因毛状根的诱导和繁殖方法。

本发明采用的技术方案是：

三叶青转基因毛状根的诱导和繁殖方法，所述方法包括：

(1)外植体的预培养：取三叶青的自然生长的植株靠顶端30cm以内的茎段，经清洗、消毒后切成0.5～1.0cm的小段；所得三叶青的茎段外植体在无菌条件下接入含萘乙酸0.5mg/L+维生素C 0.1g/L+半胱氨酸0.1g/L的MS固体培养基或含萘乙酸0.5mg/L+维生素C 0.1g/L+活性碳1g/L的MS固体培养基中，在24℃，遮盖黑暗条件下预培养20～25天，外植体经过预培养后略微愈伤化；清洗、消毒按常规方法进行，具体步骤可如下：自来水冲洗→5％洗洁精溶液漂洗5min→自来水冲洗10min→75％乙醇溶液擦洗表面→0.1％升汞溶液中消毒3～5min→无菌水冲洗4～6次；

(2)侵染和共培养：用发根农杆菌K599侵染经预培养的略微愈伤化的茎段外植体，侵染后的茎段外植体转入含乙酰丁香酮50mg/L+维生素C 0.1g/L的MS固体培养基中于24℃、遮盖黑暗条件下共培养1～2天；具体侵染步骤如下：将经过预培养的稍愈伤化的茎段将经过预培养的茎段外植体放入三角烧瓶中，加入发根农杆菌K599侵染菌液使菌液浸没外植体，在摇床上以50r/min的转速侵染5～10min；侵染结束后用无菌的镊子取出外植体，并用无菌的滤纸吸干外植体表面的菌液；

侵染菌液可按如下方法制备：取过夜培养的发根农杆菌K599菌液，转入含乙酰丁香酮10mg/L As+黄瓜碱10mg/L的YEB液体培养基中，28℃、200r/min活化处理4小时，活化后的菌液离心、弃上清，留沉淀在离心管中加入含乙酰丁香酮20mg/L的MS液体培养基将菌体悬浮；离心、弃上清，留沉淀在离心管中加入含乙酰丁香酮20mg/L的MS液体培养基将菌体悬浮；离心、弃上清，取沉淀的菌体用含乙酰丁香酮20mg/L的MS液体培养基稀释，制成侵染菌液。