[发明专利]高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌及其构建方法。

背景技术

尿嘧啶核苷酸(Uridine-5’-monophosphate，UMP)作为基础嘧啶核苷酸，具有重要的生理作用，可与其他单体核苷酸配合使用，广泛应用于食品和饲料添加剂、植物生长调节剂等方面。同时，尿苷酸参与肝脏解毒物质葡萄糖醛酸的生物合成，不仅本身可用于治疗肝炎，改善冠心病、风湿性关节炎、白细胞减少症患者的自觉症状等，还是脂核苷酸、糖核苷酸以及低聚核苷酸类似物的合成原料，这些核苷酸衍生物对肿瘤和被感染的病毒细胞可以有效地释放核苷，提高抗病毒效果。其市场需求很大，蕴含有良好的商业潜力。

近几年国内外涌现出很多关于微生物发酵法制备UMP的专利报道，主要的工作都集中在菌种改造方面，主要的方法还是通过传统的诱变方法，筛选出嘧啶类似物(2-硫尿嘧啶(2-TU)、6-氮尿嘧啶(6-AU)、尿嘧啶、氟尿嘧啶)抗性菌株，氨甲酰磷酸类似物抗性(璜氨胍)菌株，或者嘌呤类似物抗性菌株。但由于诱变工作量大、盲目性高，而且所筛选到的突变株的生理状态处于病态或完全失调的情况下，所以产量的进一步提高有一定的局限性。新的策略就是用基因工程技术来改造菌株。利用DNA重组技术，建立一整套克隆载体系统，通过基因分离、鉴定、克隆、转移和表达进行定向培育来制备有价值的菌株。并期望通过克隆增加限速酶基因拷贝数或通过对所克隆基因的定点突变技术来消除反馈调节和代谢旁路调节等多种DNA操作途径，增强基因的表达能力，从而提高产量。

UMP是嘧啶核苷酸合成途径中处于结点位置的重要核苷酸，由它可以进一步合成其他嘧啶核苷酸。工业上所用的生物催化法合成UMP通常是以乳清酸为底物，通过从头合成途径，利用菌体自身产生的5-磷酸核糖焦磷酸(5-PRPP)，经过两步酶反应合成UMP。参与反应的两个酶分别是乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRTase EC 2.4.2.10)和乳清苷酸脱羧酶(ODCase EC 4.1.1.23)。OPRTase是嘧啶核苷酸从头合成途径的第五个酶，也是催化法合成UMP的第一步反应酶。该酶催化乳清酸转移到5-PRPP上，释放一分子焦磷酸(PPi)，形成乳清苷酸(OMP)，再被ODCase催化脱羧形成UMP。因此，利用基因工程手段，克隆高活性的OPRTase基因和ODCase基因，构建OPRTase和ODCase共表达的双酶耦联系统，以乳清酸为原料生产UMP，是UMP高效合成的一条可行途径。此途径具有工艺简单、条件温和、周期短、副产物少等优点，而且清洁无污染，最终实现UMP的高效清洁生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌。

本发明还要解决的一个技术问题是提供上述重组菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌株已于2011年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.5047。

上述高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌，它包含乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE和乳清苷酸脱羧酶基因ODCase pyrF的大肠杆菌，所述的乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032，所述的乳清苷酸脱羧酶基因ODCase pyrF来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。

其中，所述的乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因长度为555bp，编码了184个氨基酸和一个终止密码子，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，计算分子量和理论等电点分别为19.43kDa和5.40。