[发明专利]一种获得诱导性多能干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种高效获得诱导性多能干细胞的方法。

背景技术

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)是一类高度未分化细胞，具发育全能性。在适当条件下可以无限增殖，能分化出成体动物组织和器官的所有细胞，如造血细胞、神经细胞、胰岛素细胞、心肌细胞等，在动物克隆、转基因动物生产、疾病治疗、组织工程、再生医学、疾病机理和治疗研究、药物发现和评价等诸多领域极具应用价值。

人ESCs的研究一直面临着许多难题和争议。支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行ESCs研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时的生命形式。破坏胚胎已经触及了人类伦理观念甚至宗教和法律等问题，这是人ESCs研究面临的最大障碍。同时，作为为临床组织器官或细胞移植提供大量材料的“种子细胞”，ESCs定向诱导分化的终末器官或细胞不能存在同种异型个体间的移植排斥，这就要求剔除ESCs中的免疫排斥基因，而这一难题一直困扰着免疫学界及医学界。伦理法律以及免疫排斥等壁垒，制约了ESCs技术的进一步发展和应用。

人们努力尝试不同途径实现体细胞重编程以获取ESCs或ESCs样的细胞。细胞核移植是其中的一种主要技术，即将患者体细胞与ESCs的细胞融合，但这种方法获得的ESCs是四倍体，不适用于临床，而且克隆效率低，产生的许多后代在各个阶段出现严重的发育异常。同时，卵母细胞来源使得核移植实验受到强烈伦理学质疑。

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的问世，较好地回避了长期以来围绕人类胚胎干细胞使用问题的伦理争论，同时自体细胞重编程也克服了异体移植存在的免疫排异问题。

2006，日本科学家通过导入4种转录因子Oct4，Sox2，c-Myc，Klf4成功将鼠的体细胞重编程为ESCs状态，即iPSCs，随后，人的iPSCs也用同样的基因改造方法获得。这是科学史上的重大突破，在干细胞、发育生物学和医学研究领域中具有里程碑意义。iPSCs具有与ESCs类似的生物学特征，如细胞体积较小，细胞核大，胞质胞浆少。体外培养时，细胞排列紧密，呈克隆状生长，克隆和周围存在明显界限，而形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。表达时相专一性胚胎抗原(Stage specific embryonic antigen，SSEA)，可以检查到Oct4基因的表达，SSEA和Oct4蛋白是发育全能性的标志。iPSCs还表达ESCs其它特征性表面抗原如Tra-1-60、Tra-1-81，细胞特征性内源蛋白Nanog、Sox2、Lin28等，iPSCs中碱性磷酸酶AP及端粒酶活性也较高。将iPSCs注入免疫缺陷小鼠体内，能形成含有3个胚层的畸胎瘤。iPSCs体外可以分化成多种细胞谱系，如：神经前体细胞、功能性的成熟神经细胞，造血前体细胞、造血细胞、血管内皮细胞，分泌胰岛素的β细胞，心肌细胞等。2009年7月，中国科学家周琪、曾凡一、高绍荣等利用iPSCs克隆出活体实验鼠，首次证明iPSCs与ESCs一样具有全能性。全基因组微阵列分析表明，iPSCs基因总表达谱接近于ESCs，而不是原来的靶向细胞。

患者来源的体细胞重编程获得的iPSCs，是“个体特异的”或“疾病特异的”iPSCs，不仅可以在体外大量扩增，还可以根据患者的需要，定向分化成与患者遗传上相匹配的特定组织的健康细胞，用来取代病变细胞。体细胞重编程技术为解决干细胞移植中存在的细胞来源不足，MHC不合，移植物抗宿主病(GVHD)和宿主抗移植物反应(HVGR)免疫排斥等问题提供了新思路和新技术。疾病特异性的iPSCs也是研究疾病发生机理和筛选阻止组织退行药物的重要工具。因此，iPSCs的问世成功不仅规避了干细胞研究一直以来面临的伦理和法律等障碍，而且消除了潜在的移植免疫排异反应，iPSCs替代ESCs在医学领域、组织工程、药物发现与评价等方面显示出广阔的应用前景。