[发明专利]通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物转基因技术，尤其涉及一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素(Integrin)β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛的方法，属于细胞工程领域。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth di sease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth di sease virus，FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄类动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病，世界动物卫生组织将其列为A类烈性传染病之首，一旦暴发，必须扑杀感染及接触感染的动物。2001年英国暴发口蹄疫损失约90亿英镑，占其国内生产总值的1.1％；2005年我国部分地区暴发Asia I型FMD，2009年初多个省区又发生了A型FMD，不仅造成了巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。

目前，大多数流行FMD的国家以计划免疫为主的措施预防FMD。尽管新型疫苗不断涌现，但传统灭活疫苗仍是预防FMD的基础。FMDV变异快，血清型多，且不同血清型疫苗之间没有交叉保护，故通过疫苗免疫的单一手段很难控制和根除FMD。因此，科学家们在注重疫苗研发的同时，开始关注病毒与宿主之间的关系，尤其是病毒受体在病毒感染过程中的作用，期望通过敲除、沉默或封闭病毒的关键受体阻断病毒的感染，进而达到控制和根除FMD的目的。

病毒受体是能够被病毒识别并与之结合，进而导致病毒感染的宿主细胞表面分子，是病毒宿主特异性和组织嗜性的关键因素。FMDV体外感染的受体包括整合素(Integrin)及硫酸乙酰肝素(HSPGs)。一些FMDV弱毒及细胞培养适应毒株可利用HSPGs感染体外培养的细胞(O’Donnell等，2008)，但HSPGs可能只作为一种附属分子增强其它受体的效率，尚无证据表明其在FMDV野毒株感染细胞过程中起作用(Monaghan等，2005)。

整合素αv亚家族成员中αvβ1、αvβ3、αvβ6及αvβ8是FMDV感染体外细胞的表面受体(Gutierrez-Rivas等，2008；Berryman等，2005；Jackson等，2000；Goodwin等，2009；Ruiz-Sáenz等，2009；Johns等，2009)，其中整合素受体β6亚基是启动FMDV强毒自然感染的关键性β受体亚基，原因在于：(1)FMDV主要经上呼吸道感染动物，在口咽或相关淋巴组织的上皮细胞起始复制后迅速扩散到口部和蹄部的上皮细胞。在4种整合素受体中，只有αvβ6仅限于FMDV组织嗜性的上皮细胞表面持续且高水平的表达(Berryman等，2005；Monaghan等，2005；Brown等，2006)，感染病毒的上皮细胞可同时检测出αvβ6和病毒抗原(O′Donnell等，2009)。(2)体外合成的αvβ6可与所有血清型的FMDV结合(Ferris等，2005)，并且亲和力最强(Burman等，2006)，这不仅提高了FMDV的感染率(DiCara等，2008；Duque等，2004)，而且也使β6亚基成为FMDV整合素受体中利用率最高的β亚基(Duque等，2003)。(3)不仅FMDV非敏感细胞转染β6亚基基因后可被病毒感染(Jackson等，2000)，而且抗β6抗体可抑制受体与病毒间的结合并阻断病毒感染(等，2007；Jackson等，2000)。

转基因动物的制作方法主要有逆转录病毒法、受精卵原核显微注射法、精子载体法、ES细胞技术和转基因体细胞核移植技术等。其中受精卵原核显微注射法和转基因体细胞克隆是目前世界各国科学家比较常用的家畜转基因技术，前者最早由美国人Gordon发明，是经典的制作转基因动物的方法。Hammer等利用该方法成功地制作了转基因兔、绵羊和猪，这些研究被认为是动物转基因研究历程上的里程碑。总体上看显微注射法生产转基因动物的效率较低，后代嵌合体比例较高，尤其是大动物，受体需要量大，维持大量动物的饲养成本与试验成本昂贵，研发成本高，风险大。