[发明专利]土壤中根肿病菌的特异性PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种土壤中根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)的特异性PCR检测方法，特别是涉及一种土壤中芸薹根肿病菌的特异性PCR检测方法。

背景技术

十字花科植物根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染引起的一种世界性土传病害，可以危害青菜、卷心菜、甘蓝、白花菜、西兰花、油菜等许多十字花科植物，造成植株地下部根的畸形肿大以及地上部植株矮小、萎蔫，导致作物的产量严重下降或者绝收。病原菌从腐烂的肿大根组织中释放出大量的游动孢子，进而发展成休眠孢子进入田块，田块一旦受到根肿病菌的污染，将长期带菌，不再适宜栽培十字花科植物。因此，该病严重威胁十字花科作物的生产。

十字花科植物根肿病最早发现于18-19世纪的地中海西岸和欧洲南部，现在许多国家都有发生。在我国浙江、广东、广西、湖南、福建、江西、江苏、安徽、四川、云南、新疆、西藏、辽宁、山东、台湾、上海、北京等省、市、自治区均有分布。近年来，我国部分地区大白菜根肿病发生面积急剧增加，在上海，2006年上海郊区某西兰花出口基地根肿病严重发生，导致西兰花因不能结球几乎绝产，只能改种其它非十字花科作物。

据报导根肿病菌休眠孢子能在土壤中存活15年以上，带菌土壤中根肿菌的休眠孢子很容易通过农用机械、鞋子、家畜的粪便、带菌植株的移栽和灌溉水等方式传播，这使得作使土壤中根肿病菌休眠孢子的数量突增。由于Plasmodiophora brassicae属专性寄生菌，不能在人工培养基上生长，故不能像其它非专性寄生菌一样通过分离、培养来检测土壤是否带菌。

应用感病指示作物可以测定土壤是否带菌，然而这种方法要求土壤带菌量至少在10³个孢子/克干土以上，且需8周时间才能观察到植株根部肿大。利用分子手段检测根肿病菌的发展迅速，Faggian等(1999年)就报道检测根肿病菌的专一性PCR引物，然而因土壤中存在大量的抑制物质干扰根肿病菌PCR检测的灵敏度，许多检测方法在检测土壤中根肿病菌时检测的灵敏度不高。

因此，亟须一种十分高效、灵敏的检测方法来弥补上述不足。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种土壤中根肿病菌的特异性PCR检测方法，以显著提高现有的土壤中根肿病菌检测方法的灵敏度，弥补现有技术的缺陷。

本发明通过对上海郊区十字花科蔬菜根肿病菌核糖体DNA ITS序列的测定与分析，与近源种、土壤中常见种及十字花科常见病原菌进行比较，设计了6对引物，经过特异性检验、多种方法提取土壤DNA的PCR检测并与现有的检测引物比较，建立了一种更为灵敏的PCR检测方法，对于土壤中根肿病的快速监测及田块根肿病危害的风险评估具有非常重要的现实意义和应用价值。

具体来说，本发明测定了引起上海地区十字花科青菜根肿病菌的病菌核糖体DNAITS序列，通过与根肿菌纲不同种、土壤中卵菌纲不同病原菌种及镰刀菌不同种间序列的比较，设计了芸薹根肿病菌PCR检测的特异性正向引物2个(PbF1、PbF2)、反向引物3个(PbR1、PbR2、PbR3)，组成6对引物对，进行目标青菜根肿病菌、青菜上其它病原菌种类、卵菌纲不同病原菌种类及镰刀菌不同种类PCR扩增反应的特异性检验，并对采用不同方法提取的土壤DNA进行根肿病菌灵敏度检测的PCR扩增反应。

其中，本发明所设计的6对引物对序列分别如下：

引物对1：正向引物PbF1：5′atcattaaca cagtgggcgg 3′(参看SEQ ID No 1)

         反向引物PbR1：5′cgcgcaaacg aacagaaa 3′(参看SEQ ID No 2)

引物对2：正向引物PbF1：5′atcattaaca cagtgggcgg 3′(参看SEQ ID No 1)

         反向引物PbR2：5′gcagcaaagc tcattgtctt 3′(参看SEQ ID No 3)

引物对3：正向引物PbF1：5′atcattaaca cagtgggcgg 3′(参看SEQ ID No 1)

         反向引物PbR3：5′tcgttcaagc tatgccgc 3′(参看SEQ ID No 4)

引物对4：正向引物PbF2：5′ctagcgctgc atcccatat 3′(参看SEQ ID No 5)