[发明专利]重组人促红素-CTP融合蛋白生产工艺及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物制药工艺领域。其具体涉及一种重组人促红素与人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽的融合蛋白的一种生产工艺方法，包括该融合蛋白的重组工程细胞株的获得、细胞培养及蛋白纯化工艺方法以及重组人促红素-CTP融合蛋白在猴药代实验和对大鼠肾性贫血治疗上的应用。

背景技术

EPO是一种主要由肾脏产生的糖蛋白，分子量约为35KD，是人体内调节红系造血的主要激素，在红系祖细胞的增殖、分化和成熟中起着重要的调控作用。目前我国对EPO需求量逐年递增，但是普通EPO存在体内半衰期短，患者给药次数频繁等问题。因此如何延长其体内半衰期，以降低给药频次，成为当前EPO药物的研究热点。目前常用的技术手段有三种，一是使EPO进行PEG化(专利号200880021159.4)，二是通过氨基酸突变增加糖化位点(美国安进公司的Aranesp，已上市)，三是使其与一些大分子蛋白或高糖化片段相连形成融合蛋白，目前已有文献报道有EPO-FC(见专利申请号200880005733.7)、EPO-HAS(见专利申请号200410053319.7)和EPO-CTP文献报道(《Development of a Long-Acting Erythropoietin by Fusing the Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chorionic Gonadotropin_-Subunit to the Coding Sequence of Human Erythropoietin》)等。

本发明所述的融合蛋白是参考上述专利及文献基础设计的，在EPO的羧基末端增加一段带有人绒毛膜促性腺激素β亚基的肽链。人绒毛膜促性腺激素(hCG)是胚胎滋养层细胞分泌的一类具有重要生理功能的糖蛋白激素，由两个不同的亚基α、β以非共价键连接组成，CTP短肽是人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽。人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽能够增加唾液酸含量，增加分子量，延长半衰期而不影响EPO蛋白活性，已有文献报道(《Development of a Long-Acting Erythropoietin by Fusing the Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chorionic Gonadotropin_-Subunit to the Coding Sequence of Human Erythropoietin》)支持其可使EPO半衰期延长2-3倍。

由于EPO为高糖化蛋白，其分子量的40％为糖，融合CTP短肽后其糖基化程度更高，因此EPO-CTP融合蛋白的生产也必须选用糖化修饰较完善的哺乳动物细胞表达系统。重组糖蛋白类药物的生产目前较成熟的生产表达系统为哺乳动物细胞表达系统，最常用的细胞系为中华仓鼠卵巢细胞(CHO)。目前哺乳动物细胞大规模培养方法可以分为：贴壁培养、悬浮培养和固定化培养。贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行单层培养。由于细胞固定于表面，不需要复杂的细胞截流装置，便于采用灌注培养。悬浮培养是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要适用于非贴壁依赖性细胞培养。固定化培养是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养的一种方法。

本发明中EPO-CTP融合蛋白的生产可采用两种细胞培养方式，即微载体贴附灌注培养和悬浮流加培养方式。其特点是采用剪切力小，传氧效果好的，混合方式为摇动式混合的激流式细胞生物反应器。第一种培养方式采用微载体贴附悬浮灌注培养，微载体可支持细胞高密度、长时间生长，且微载体悬浮于培养液内，可实现较高的传质传氧效率，此种培养方式可不断补充新鲜培养液、排出代谢废物、延长细胞表达时间，并且利用悬浮培养营养物质、溶解氧混合均匀的特点，从而提高重组蛋白产量，为一种新型实用的生产高糖化重组蛋白的方法。第二种培养方式为悬浮流加培养，主要是用于可以通过悬浮驯化并适应悬浮培养的细胞。悬浮流加培养工艺操作简单、可靠灵活，特别是利用激流式细胞生物反应器传氧效果好，一次性反应袋操作方便，可大大缩短培养周期，易于放大培养规模，通过工艺的简单控制，即可满足EPO-CTP生产需求。

本发明对利用此种生产方法生产的融合蛋白在动物体内的应用进行了研究，融合蛋白在食蟹猴体内的药代实验数据显示出优于普通EPO的半衰期。在大鼠肾性贫血治疗上，融合蛋白可达到一周给药一次的长效作用。

发明内容