[发明专利]卵巢癌原发化疗敏感性测评试剂盒及其应用无效
申请号: | 201110266041.1 | 申请日: | 2011-09-08 |
公开(公告)号: | CN102435734A | 公开(公告)日: | 2012-05-02 |
发明(设计)人: | 崔世英;丁艳芳;赵瑾瑶;杨亮;毕丽华;姜继勇 | 申请(专利权)人: | 大连医科大学 |
主分类号: | G01N33/574 | 分类号: | G01N33/574 |
代理公司: | 大连东方专利代理有限责任公司 21212 | 代理人: | 刘晓琴 |
地址: | 116044 *** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 卵巢癌 化疗 敏感性 测评 试剂盒 及其 应用 | ||
1.卵巢癌原发化疗敏感性测评试剂盒,其特征在于该试剂盒包括:由5%山羊血清、1%BSA、0.01%聚乙二醇辛基苯基醚和pH7.4的磷酸缓冲液组成的封闭液,由ERCC2抗体、生物素化二抗工作液和封闭液组成的抗原抗体反应系统,由辣根酶标记链霉卵白素工作液和DAB试剂缓冲液组成的抗生物素蛋白-氧化物酶反应系统,以及作为复染剂的苏木精。
2.权利要求1所述的试剂盒,其特征在于所述试剂盒还包括由0.01M柠檬酸盐缓冲液和磷酸缓冲液组成的抗原修复系统,以及由3%过氧化氢和磷酸缓冲液组成的消除内源性过氧化物酶系统。
3.测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法,其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒,包括如下步骤:使用封闭液处理待测样品后,分别使用ERCC2抗体和生物素化二抗工作液进行一抗和二抗反应,然后使用辣根酶标记链霉卵白素工作液处理样品,最后进行DAB显色和苏木精复染;
根据样品染色情况判定对化疗药物的敏感性:呈褐色阳性反应的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织;呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组织。
4.权利要求3所述的方法,包括如下步骤:
①封闭:在待处理样品的组织上加200μl封闭液,室温孵育60分钟;
②抗原抗体反应:
(1)一抗孵育:在组织上加150μl按照1∶100比例稀释的ERCC2抗体,以封口膜覆盖组织,于4℃孵育过夜,然后以PBS清洗3次,每次10分钟;
设阴性对照组,用同体积封闭液代替ERCC2抗体;
(2)二抗孵育:在组织上加150μl生物素化二抗工作液,室温孵育60分钟,PBS清洗3次,每次10分钟;
③在组织上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP),室温孵育60分钟,PBS清洗3次,每次10分钟;
④DAB显色:
(1)制备底物混合液:在1ml pH值=7.0的双蒸水中,加入一滴试剂A,混合均匀后,将试剂B和试剂C各一滴加入其中,混合均匀得底物混合液;
(2)显色:将150μl底物混合液滴加在组织上,室温显色3~10分钟,充分显色后自来水冲洗终止反应;
⑤染色、脱水、透明、封片:将组织切片浸入苏木精染液2次,每次2秒;然后用蒸馏水处理3次,每次5分钟;再依次以50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇各处理1次,每次1分钟;再以无水乙醇处理2次,每次2分钟,二甲苯与无水乙醇1∶1混合物处理1次,2分钟,100%二甲苯处理2次,每次2分钟;最后用树胶封片,保存;
⑥根据样品染色情况判定对化疗药物的敏感性:呈褐色阳性反应的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织;呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组织。
5.权利要求3所述的方法,其特征在于:所述方法应用于卵巢癌福尔马林固定石蜡包埋组织的测评时,还包括对样品的预处理步骤:
a.脱蜡:卵巢癌福尔马林固定石蜡包埋组织常规切片,厚度4~5μm的石蜡组织切片依次经过100%二甲苯脱蜡3次,每次5分钟;无水乙醇脱蜡3次,每次2分钟;95%乙醇、90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇各脱蜡1次,2分钟;
b.抗原修复:以0.01M柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复,然后以PBS清洗3次,每次5分钟;
c.消除内源性过氧化物酶:将组织切片置于3%过氧化氢中,室温孵育30分钟,用PBS清洗3次,每次5分钟。
6.筛选对原发化疗药物敏感的卵巢癌患者的方法,其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒,包括如下步骤:以卵巢癌患者离体肿瘤组织为检测样品,使用封闭液处理待测样品后,分别使用ERCC2抗体和生物素化二抗工作液进行一抗和二抗反应,然后使用辣根酶标记链霉卵白素工作液处理样品,最后进行DAB显色和苏木精复染;
根据样品染色情况判定样品来源的卵巢癌患者对原发化疗药物敏感性:呈褐色阳性反应的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织,样品来源的卵巢癌患者对原发化疗药物敏感;呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组织,样品来源的卵巢癌患者对原发化疗药物耐受。
7.权利要求3~6中任一权利要求所述的方法,其特征在于所述的原发化疗药物是顺铂、紫杉醇或二者的组合。
8.权利要求3~6中任一权利要求所述的方法,其特征在于所述的卵巢癌是浆液性卵巢癌。
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