[发明专利]一种细菌源降纤酶制备方法

权利要求书

1.一种细菌源降纤酶制备方法，其特征在于：将粪肠球菌EF608菌株发酵培养，发酵液离心去沉淀，上清液加固体硫酸铵至饱和度达60%-65%，盐析组分经透析浓缩，得粗提液，粗提物依次过苯基琼脂糖凝胶FF疏水层析柱、DEAE-Sephadex A-25 离子交换层析柱和Sepharose-肝素亲和层析柱，得到高丰度纤溶活性峰，透析、冷冻干燥，得到纯品即为细菌源降纤酶。

2.根据权利要求1所述一种细菌源降纤酶制备方法，其特征在于具体按如下步骤进行：

（1）以粪肠球菌EF608菌株为提取物，将粪肠球菌EF608菌株发酵培养；

（2）硫酸铵沉淀：取发酵液，离心、弃沉淀，上清液中加入固体硫酸铵，使其硫酸铵饱和浓度达到60%-65%，盐析组分经透析浓缩，得粗提液；

（3）苯基琼脂糖凝胶FF疏水层析：将粗提物过苯基琼脂糖凝胶FF疏水层析柱，用50mmol/L Tris-HC1和1 mol/L (NH₄)₂SO₄的混合缓冲液，pH为7.5进行平衡，用50mmol/L Tris-HC1pH为7.5的缓冲液洗脱；收集目的峰，透析，冷冻干燥，4℃保存；

（4）DEAE-Sephadex A-25离子交换层析：将目的峰组分过DEAE-Sephadex A-25 离子交换层析柱，用50mmol/L Tris-HC1pH为7.5进行平衡，用50mmol/L Tris-HC1pH为7.5的Buffer 在0～0.5 mol/L范围内逐渐增加NaCl提高盐浓度，做线性梯度洗脱；对各峰的收集溶液隔管测定纤溶活性，收集有纤溶活性的目的峰，透析，冷冻干燥，4℃保存；

（5）Sepharose-肝素亲和层析：将目的峰组分过Sepharose-肝素亲和层析柱，用50mmol/L Tris-HC1pH为7.5的Buffer进行平衡；用50mmol/L Tris-HC1pH为7.5的Buffer 在0～0.5 mol/L范围内逐渐增加NaCl提高盐浓度，做线性梯度洗脱；收集有纤溶活性的峰，透析、冷冻干燥，得到纯品即为细菌源降纤酶。

3.根据权利要求2所述一种细菌源降纤酶制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中发酵液的离心为8000 rpm离心10min。

4.根据权利要求1所述一种细菌源降纤酶制备方法，其特征在于：所述粪肠球菌EF608菌株发酵培养具体分为两个步骤：

（1）种子培养：种子培养基以g/100mL计：称取葡萄糖1.0g，蛋白胨1.0g，酵母提取物0.5g，K₂HP0₄·3H₂0 1.0g，NaCl 0.2g，MgS0₄·7H₂0 0.02 g，调pH至 7.5，121℃ 高温高压灭菌 20 min，于 37℃、180 rpm 恒温培养12~16小时；

（2）液体发酵培养：液体发酵培养基以g/100mL计：称取葡萄糖2.0 g，蛋白胨0.5 g，牛肉膏0.5 g，酵母提取物0.5 g，K₂HP0₄·3H₂0 1.0 g， NaCl 0.2 g，MgS0₄·7H₂0 0.02g，调pH至 7.5，121℃高温高压灭菌 20min；种子培养基按体积百分比6%接入装液量为4升液体发酵培养基的20升发酵罐中，培养条件为：搅拌速度180 rpm,培养温度为35~40℃，培养时间10~12小时。