[发明专利]汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种引物阵列，尤其涉及一种汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列(Primer Array)及制备方法和应用。

背景技术

线粒体通过氧化磷酸化(OXPHOS)产生人体用于工作的ATP和维持体温的热量，处于新陈代谢和生物能量转换的中心地位。线粒体DNA(mtDNA)是细胞内除nDNA外唯一存在的遗传物质。其中，mtDNA编码区所编码的13个多肽是电子传递链的重要组成成分。近年来的研究证明，线粒体不仅为机体提供能量，其遗传结构和生理功能的缺陷又与机体的多种疾病的发生密切相关(即线粒体疾病)，并且，定义线粒体DNA单倍型的“非致病性”DNA遗传变异与人类的多种疾病的易感性密切相关。目前，对绝大多数线粒体遗传病尚无有效的治疗方法，而许多线粒体遗传病又具有致残性，病人生活质量差，而社会、家庭不但要支付其生活费、医疗费，还要安排专人料理其生活，给社会、家庭以沉重的经济负担。

基因芯片又称DNA芯片、DNA微探针阵列等等，它是将半导体工业的微型制造技术与分子生物学结合起来，在玻璃、陶瓷、金属片或尼龙膜、硝酸纤维素膜等基片物质表面上产生二维DNA探针阵列，然后将待测定未知目标DNA与芯片上已知DNA探针“杂交”，以确定未知DNA分子。Real-Time PCR技术是在PCR反应体系中添加荧光物质或含荧光基团的探针，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR的过程，以达到对未知样品的定性或定量分析的目的，与常规PCR技术和芯片技术比较，其快速、精确、定量、无污染及高通量等优点成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。目前，检测线粒体DNA单倍型的技术是基于PCR的RFLP(restriction fragment length polymrphism)以及测序等技术。但这些技术对于大样本人群来说，在不同程度上存在程序复杂、工作量大、繁琐、费时和设备要求高等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列，它具有灵敏度高、特异性好、操作简单、快速、精确、定量、无污染及高通量等优点，适合临床实验室和科研开展。

本发明的技术方案是：

一种汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列，包括固相载体、滴加在该固相载体上的Q-PCR(Real-time Quantitative PCR，Q-PCR)特异性引物以及在PCR反应体系中添加荧光物质，所述滴加在所述固相载体上的Q-PCR特异性引物具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：16所示的寡核苷酸序列。

所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列，还包括滴加在该固相载体上的Q-PCR特异性引物作为阴性对照，其中，阴性对照Q-PCR特异性引物具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：16所示的寡核苷酸序列。由于引物阵列制备时已滴加有Q-PCR特异性引物，因此，用本发明所述引物阵列检测时仅滴加Q-PCR反应液和基因组DNA模版。

所述固相载体为96孔PCR反应板。

所述荧光物质为SYBR Green I。

本发明的另一个目的是提供上述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列的制备方法，其有如下步骤：

1)采用亚磷酰胺三酯法合成SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：16所示的Q-PCR特异性引物；

2)将步骤1)中合成的Q-PCR特异性引物按浓度为100-300nM滴加到Q-PCR反应板中，阴性对照点为仅含引物而后续实验时不加任何基因组DNA模板的点样液，制得所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列。

采用汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列的检测方法，有步骤：

1)Q-PCR反应混合液量的准备：根据96孔Q-PCR反应板的孔数来确定Q-PCR反应数，一般1个96孔PCR反应板需要准备100次Q-PCR反应的2×Q-PCR混合液(含荧光染料SYBR Green I，北京天根生化科技有限公司)，依次类推。

2)将步骤1)制得的Q-PCR反应液滴加到本发明所述引物阵列的待测标本区；

3)DNA样品操作前的准备工作：为避免外源DNA对待测DNA样品的污染，所有实验要严格遵守DNA操作的要求。在实验操作中，需戴口罩和一次性橡胶手套；