[发明专利]核酸定量方法和用于核酸扩增反应的微芯片

说明书

技术领域

本发明涉及核酸定量方法以及用于核酸扩增反应的微芯片。具体地，本发明涉及用于方便地测量样本中所包含的检测对象核酸链的近似量的核酸定量方法。

背景技术

诸如PCR(聚合酶链反应)的核酸扩增方法已经被用在许多应用中，包括传染和遗传性疾病的诊断、基因表达水平分析和克隆。基于用于测量的荧光染料或荧光染料标记的荧光探针的增加的荧光强度来实时测量检测对象核酸链的扩增量的实时核酸扩增方法也已经用于检测对象核酸链的原始量的定量。

Digital PCR，Proc.Natl.Acad.Sci.1999，Vol.96，p.9236-9241提出了被称为“数字PCR”的技术，用于准确地定量痕量的核酸链。在数字PCR中，包含检测对象核酸链的样本受到反应溶液的有限稀释，并且被分配到多个反应场所(井)供PCR反应。然后，使用(例如)荧光探针来对呈现有来自扩增产物的荧光的井(well，孔)数量进行计数。因为可以假定借助于每个井至多包含检测对象核酸链中的仅一个分子(一个副本)的有限稀释，所以包含在样本中的检测对象核酸链的副本数量可以基于呈现有荧光的井的数量来定量。

JP-A-2001-269196提出了一种基于数字PCR的核酸定量方法，该方法使用包括数百至数百万流路(反应场所)的平板，每个流路包含有样本中所包含的检测对象核酸链的一个副本。通过此方法，可以准确地定量检测对象核酸链的副本数量，这是因为该方法不涉及荧光井的数量和检测对象核酸链的副本数量之间的不匹配，其中，这种不匹配在一个流路包含检测对象核酸链的多于一个副本时出现。

发明内容

如上所述，数字PCR能够准确地定量样本中的检测对象核酸链的副本数量。考虑到核酸扩增方法旨在定量核酸链的量，需求测量样本中病原体基因组的近似量，尤其是在传染病的诊断方面，以检查病原体水平并且确定传染病或疾病的严重程度或发展阶段。在不是为了准确地测量mRNA副本数量而是为了简单地检查mRNA的表达水平的基因表达水平分析中期望使用这种半定量测量方法。

相应地，需要一种能够简单地测量样本中包含的检测对象核酸链的近似量的技术。

本发明的实施方式针对使用用于核酸扩增反应的微芯片的核酸定量方法，该微芯片包括：入口，液体经该入口从外部被引入；多个反应区域，被设为核酸扩增反应的反应场所；以及，流路，从该入口引入的液体经由该流路被供应至该多个反应区域中的每一个反应区域，其中，发生核酸扩增反应的可能性在各反应区域之间是不同的，该方法包括：使含有检测对象核酸链的溶液流经该流路，并且将该溶液引入该多个反应区域中的每一个反应区域以执行核酸扩增反应；以及，检测该多个反应区域中的每一个反应区域中的扩增产物，以确定其中发生了核酸扩增反应的反应区域。

核酸定量方法能够基于在确定的反应区域中的核酸扩增反应的可能性来测量溶液中的检测对象核酸链的近似量。具体地，当确定的反应区域是核酸扩增反应不太可能发生的反应区域时，核酸定量方法可以确定溶液包含较大量的检测对象核酸链。

在核酸定量方法中，用于核酸扩增反应的微芯片的反应区域可具有不同的内部容积或者可以以不同的量预先存储至少部分必要反应物质，以使各反应区域内发生核酸扩增反应的可能性不同。在该反应区域中预先存储的必要反应物质是寡核苷酸引物和/或酶。

本发明的另一实施方式针对一种用于核酸扩增反应的微芯片，该微芯片包括：入口，液体经该入口从外部被引入；多个反应区域，被设为核酸扩增反应的反应场所；以及，流路，从该入口引入的液体经由该流路被供应至该多个反应区域中的每一个反应区域，其中，发生核酸扩增反应的可能性在各反应区域之间是不同的。

用于核酸扩增反应的微芯片可被构造成使得反应区域具有不同的内部容积或者以不同的量预先存储至少部分必要反应物质，以使各反应区域内发生核酸扩增反应的可能性不同。

在用于核酸扩增反应的微芯片中，流路可以连接反应区域，使得被引入到多个反应区域中的一个反应区域的液体通过溢出流路而被依次引入到相邻反应区域。