[发明专利]同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于保健品、功能食品和生物医药领域，具体的说涉及一种同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法与应用。

背景技术

进入21世纪，世界范围内形成了开发海洋湖沼资源的热潮，海洋药物的开发有着巨大的发展潜力。其中，广泛、大量存在于藻类藻胆体中的藻胆蛋白，由于其安全无毒、具有多方面的开发应用价值和较高的生物活性，而引起了不少学者的关注。藻胆蛋白为一类色素复合蛋白，根据其吸收光谱性质可分为藻蓝蛋白(Phycocyanins，PC)、别藻蓝蛋白(Allophycocyanins，APC)、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)和藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin，PEC)。藻胆蛋白不仅可作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业，而且由于其具有强烈荧光所制成的荧光试剂、荧光探针、荧光示踪物质等用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域中，具有明显抗氧化、抗炎症、提高机体免疫力、促进动物细胞再生、抑致癌细胞的作用等生物活性(Farooq et al，Chem-Biol Interact，2004，149，1-7；Subhashini et al，Biochem Pharmacol，2004，68：453-62；Chen and Wong，J Agric Food Chem，2008，56，4352-4358)。已有的研究结果均表明藻胆蛋白具有良好的应用开发前景。

目前，关于藻胆蛋白的提取工艺研究相对落后，且产物稳定性较低，极大的限制了其工业化生产的发展。对于藻胆蛋白的粗提取，细胞破碎方法的选择是关键步骤。目前国内外基本采用采用反复冻融法、超声波破碎法、匀浆法、物理破碎、酶溶法、化学渗透法和十二烷基苯磺酸钠裂解法等方法来破碎藻细胞(Santiago-Santos et al，Process Biochem，2004，39，2047-2052)。其中以反复冻融-超声破碎联用法使用最为广泛，破碎效果好，可获得大量的藻胆蛋白粗产品，更适合于规模化开发。但要进一步分离纯化得到藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白必须通过柱层析等其他方法处理。关于蛋白沉淀都普遍使用硫酸胺盐析或冷冻丙酮沉淀。在纯化技术上，目前使用的有离子交换色谱和体积排阻色谱法(Chen and Wong，Phytochemistry，2006，67，2424-2430.)、膨胀床吸附色谱(Niu et al，J Chromatogr B，2007，850：267-276.)、疏水性相互作用色谱等。其中，离子交换色谱和体积排阻色谱单独使用或串联使用是常用的也是首选的分离螺旋藻中藻蓝蛋白的纯化方法，但所需的填料昂贵，且不能一次性分离藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。近来有研究人员采用双水相萃取方法多次萃取得到纯化的藻蓝蛋白(Pail G and Raghavarao，Biochem Eng J，2007，34：156-164)，但该技术目前仍不够成熟，有待进一步优化。专利号为200610171008.X、名称为“同时制备藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法”的国家发明专利提供了一种采用羟基磷灰石柱层析法同时制备藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，但所得产品纯度仅为2.1，无法达到生物医药领域的使用要求。因此，如何快速有效的同时分离高纯度藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白成为人们关注的焦点和努力的方向。

目前有研究表明含硒、碲藻蓝蛋白在抗氧化、抗肿瘤等生物活性方面的表现优于普通藻蓝蛋白(Chen and Wong，J Agric Food Chem，2008，56：4352-4358)，因此，如何分离纯化含硒、碲的藻胆蛋白类似物也具有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法。

本发明的另一目的在于提供所述同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，包含以下步骤：

(1)将螺旋藻干粉溶于磷酸盐缓冲溶液中，反复冻融，超声破碎，离心，上清为藻胆蛋白粗提液；

(2)使用硫酸铵盐析法初步纯化藻胆蛋白粗提液，具体如下：0℃下加入饱和度为25～35％的硫酸铵溶液盐析去除杂蛋白，得到的上清液用0℃下饱和度为60～70％的硫酸铵溶液盐析，得到的沉淀用磷酸盐缓冲溶液溶解并置于透析袋中，于磷酸盐缓冲溶液中透析过夜，将透析液离心，取上清，得到初步纯化的藻胆蛋白提取液；