[发明专利]抗结核分枝杆菌单克隆抗体及其识别的抗原表位和用途

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及一种抗结核分枝杆菌CsdA单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还涉及与该单克隆抗体特异性结合的一个表位多肽以及它们的用途，本发明属于抗结核分枝杆菌CsdA单克隆抗体领域。

背景技术

结核病是严重危害人类健康的重要传染病，对公共卫生安全造成了极大的威胁。中国是结核病的高发国家，结核病人数居世界第二并有上升趋势，结核病的防控不容乐观。全球耐药结核病的发生率上升和广泛传播给结核病控制工作带来了严重威胁，为了寻找新的作用靶点，尤其是一些功能特殊的蛋白质(冷休克蛋白)是开发新药物的重要途径。

冷休克蛋白(Cold shock protein，CSP)是广泛存在于革兰氏阳性菌和阴性菌中的应激蛋白，在保护机体和帮助细胞适应低温环境方面起着重要的作用。CSP是RNA分子伴侣，其与细胞中的mRNA结合，稳定mRNA，调节蛋白质的表达。在某些病原菌中，CSPs对于其致病、传播以及应对宿主免疫系统等起着重要的作用。有研究表明，CSP与生物被膜的形成有关，生物被膜对于许多致病菌(如铜绿假单胞菌等)的致病有着重要的作用，还发现冷休克蛋白是细菌低温存活的关键蛋白，因而深入研究结核分枝杆菌冷休克蛋白的功能，能为抑制结核分枝杆菌生长提供新思路，并探索其与结核分枝杆菌致病和免疫方面的关系，可以便于寻找特异菌体抗原的靶向药物从而实现结核病的预防与治疗。

Dead-box蛋白家族属于冷休克蛋白家族中的一类蛋白，CsdA(cold-shock DEAD-box protein A)属于Dead-box蛋白家族非常重要的一个蛋白，常温下表达量极低，而在低温时会大量表达，具有RNA酶解旋活性，是核糖体结合蛋白，其功能与细胞分裂增殖有关。目前，最常用的方法是应用基因敲除或者RNA干扰技术研究CsdA蛋白在结核分枝杆菌内的作用机理，那么能否成功敲除CsdA基因或者RNAi成功，需要抗结核分枝杆菌CsdA单克隆抗体进行验证，迄今为止，尚缺乏一种抗结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体。因此，制备抗CsdA单克隆抗体对于研究结核分枝杆菌的低温存活机制具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株分泌抗结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的目的之二是提供一种抗结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体以及与该单克隆抗体特异性结合的一个表位多肽。

本发明目的之三是提供所述单克隆抗体以及与该单克隆抗体特异性结合CsdA的表位多肽的用途。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株稳定分泌抗结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(A3G5)，其微生物保藏号是：CGMCC No.5077；保藏时间为2011年7月22日；其分类命名是：杂交瘤细胞株；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述杂交瘤细胞株通过以下途径制备得到：用CsdA-his融合蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫的小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得小鼠杂交瘤细胞系，最终筛选出一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株A3G5。本发明进一步从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体。

所述CsdA-his融合蛋白由以下方法获得：将含有结核分枝杆菌CsdA核苷酸序列的pET28a-CsdA质粒载体转化大肠杆菌，IPTG诱导下获得低尿素浓度可溶的CsdA-his融合蛋白，对CsdA-his融合蛋白进行纯化，得到所述的CsdA-his融合蛋白。

本发明所述的IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D硫代半乳糖苷)可以诱导蛋白表达，能对乳糖操纵子产生极强的诱导效应，是强诱导物。

具体的，所述单克隆抗体由如下方法制备得到：

(1)免疫原的准备：将pET-28a-CsdA载体转化DE3大肠杆菌，在IPTG诱导下，分子量约64ku的CsdA以低尿素浓度可溶的形式存在。在本发明的一个优选实验方案中，以低尿素浓度、加入去垢剂和咪唑梯度洗脱对融合蛋白进行了纯化，并以纯化过的蛋白作为抗原免疫小鼠；

(2)动物免疫：用上述纯化过的CsdA融合蛋白免疫BALB/c小鼠。每只小鼠以100ug的量进行背部皮下注射，每两周一次共三次，第四次加强免疫一次，3天后待融合，获得免疫小鼠。