[发明专利]一种AKT1基因突变检测特异性引物和液相芯片

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种AKT1基因突变检测特异性引物和液相芯片。

背景技术

AKT是病毒癌基因v-akt的人类同源基因，编码丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，在PI3K相关的信号通路中起重要的作用，影响细胞的生存、增殖和侵袭，参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程。

目前研究表明，在肺癌和乳腺癌中，AKT基因激活与化疗药物抗性显著相关，AKT1基因表达升高被认为是肺癌细胞对顺铂抗性的原因；而在乳腺癌细胞的研究中，AKT激活显著增强其对化疗药物的抗性。此外，在超过90％的非小细胞肺癌中发现了AKT基因的持续激活且引起PI3K抑制剂和放射治疗的抗性。

目前，AKT1基因的疗效相关突变主要有E17K和E49K，E17K(49G＞A)突变是第17位的密码子编码的谷氨酸突变为赖氨酸，该突变改变了对激酶抑制剂的敏感性，而E49K(G145A)是第49位密码子编码的谷氨酸突变为赖氨酸，AKT1基因突变已成为药效研究的热点。

目前，对AKT1基因突变进行检测和分析的方法很少，主要有直接测序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。

发明内容

本发明的目的之一是提供AKT1基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单项或者并行检测AKT1基因两种常见基因型E17K和E49K的野生型和突变型。

实现上述目的的技术方案如下：

一种AKT1基因突变检测液相芯片，包括有：

(A).针对AKT1基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为：针对E17K位点的SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6；和/或针对E49K位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4；

(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；

(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。

优选地，所述扩增引物为针对E17K、E49K位点的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。

优选地，所述ASPE引物为：针对E17K位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5组成的序列及由SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.6组成的序列；和/或针对E49K位点的由SEQ ID NO.3和SEQID NO.7组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8组成的序列。

本发明的另一目的是提供用于AKT1基因突变检测的特异性引物。

实现上述目的的技术方案如下：

用于AKT1基因突变检测的特异性引物，其为：针对E17K位点的SEQ ID NO.5及SEQ IDNO.6；和/或针对E49K位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8。

本发明的主要优点在于：

1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的AKT1基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。